专利名称：一种人血管内皮细胞生长抑制因子的重组病毒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人血管内皮细胞生长抑制因子基因的重组载体，特别是涉及一种人血管内皮生长抑制因子重组腺病毒载体，还涉及含有该基因重组载体的药物组合物。
背景技术：
近几年来，恶性肿瘤的基因治疗是人们研究的热点。在美国已有一百多项基因治疗方案获准进入临床试用，有些治疗方案已获得了一定的效果，初步显示了基因治疗的前景。但是，缺乏特异性、靶向性及高效性一直是肿瘤基因治疗的一个难题，其中的关键是缺乏一个理想的基因载体。目前用于基因治疗研究的载体主要分非病毒载体和病毒载体两在大类，常用的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体等。腺病毒载体的转染率高、可操作性好，能携带较大的目的基因片断，可制备高效价的颗粒，且既能感染分裂细胞也可感染非分裂细胞，同时腺病毒载体安全、致病性低。但也存在不足之处，一是特异性、靶向性差，二是初次转染后易引起机体内的细胞和体液免疫反应，将其排斥而失效，从而影响了基因表达的稳定性和持续性，但腺病毒载体E1及E3缺失区携带外源性基因，可以实现目的基因的较长时间的表达；逆转录病毒载体能携带外源性基因整合进靶细胞基因组中实现目的基因稳定持久的表达，但逆转录病毒体外繁殖滴度低、只感染正在分裂的细胞，且存在对染色体的随机整合，有激活癌基因或灭活抑癌基因而致癌的危险性。
技术方案本发明的目的是提供一种重组腺病毒，使得人血管内皮细胞抑制因子(Endostatin)与腺病毒连接后可直接在真核细胞中表达。利用Endostatin抑制血管内皮细胞生长的特点，将其克隆到腺病毒E1缺陷株，使腺病毒特异性地将Endostatin带入肿瘤组织，抑制肿瘤周边及肿瘤实体内血管生成，从而使肿瘤产生无营养状态而凋亡，这就避免了在体外制备蛋白质过程中由于原核细胞表达产物无糖基化和磷酸化修饰而活性不高、提取纯化过程导致蛋白质活性下降等不利因素的影响。
本发明是一种基因治疗重组病毒利用腺病毒顺式活化序列(cis-acting secquence)与CMV(Cytomegalovirus，巨细胞病毒)启动子操纵人血管内皮细胞抑制因子(Endostation)组建成转染率高、靶向性和组织特异性好、由单启动子控制的癌特异性基因治疗病毒。其技术方案为以5’ATCGTCAACCTAGGAG和3’TAGCATGTACGATGTAC引物，通过PCR扩增人血管内皮抑制因子基因，将扩增的Endostatin基因以内含Endostatin基因的pE18为模版亚克隆到原核质粒pUC19，再利用Clal和BamH1亚克隆到pQB1-AdCMV5(含有腺病毒E1A)，与QB1-viralDNA进行共转染，阳性病毒克隆经PCR筛选，扩增，转染293细胞培养。
此重组病毒具有下列特点1、具有腺病毒载体转染率高、可操作性好，能携带较大的基因，可制备高效价的病毒颗粒，宿主范围广，安全性好，致病性低的优点；同时降低其引起的免疫反应，可使外源基因获得稳定、持久的表达。
2、由CMV启动子控制内皮细胞生长抑制因子(Endostatin)高效表达，诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡，抑制肿瘤新生血管的形成，阻断肿瘤组织的血液供应，抑制肿瘤的发展；同时，裂解肿瘤细胞。
3、由病毒载体将内皮细胞生长抑制因子(Endostatin)基因导入靶组织中表达，此产物折叠率、磷酸化、糖基化都会明显优于原核细胞表达之产物，具有较高的生物活性，直接在肿瘤局部充分发挥其抑瘤作用。
本产品利用腺病毒携带血管内皮细胞生长抑制因子基因，从工艺上解决了用双岐杆菌或大肠杆菌表达系统的变性及活性低等缺点。用腺病毒以及腺病毒相关病毒进行癌症治疗，病人可在体内持续、高效表达，并在蛋白质分子修饰程序上如蛋白质磷酸化、二酯键及蛋白质折叠等方面都具有与真核生物相近的特性，所以其单位活性明显优于原核细胞表达系统。本发明的人血管内皮细胞生长抑制因子(Endostatin)与腺病毒连接可直接在真核细胞中表达，也就是说可以直接导入实体瘤部位让其表达使受治疗者自身变成一个生产血管内皮生长抑制因子的“工厂”。这种方法能够克服制备蛋白不稳定、半衰期短、活性低、成本高等缺点，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。
其中实验所用的293细胞通过人肾上皮细胞经腺病毒5型DNA转化得到。详细资请参阅Graham FL et al.Defective transforming capacity ofadenovirus type 5 host range mutants.Virology 8610-21，1978Pubmed78205587.
图1是重组腺病毒的碱基序列结构。
图2是腺病毒载体的构建示意图。
图3是重组人血管内皮细胞生长抑制因子的生产技术路线框图。
图4是以5’ATCGTCAACCTCAGGAC和3’TAGCACGATGTACCCGTGAT为引物，以胶原cDNA为模版，通过PCR扩增得到的310bp的Endostatin片断的PAGE图。
图5是Ad/CMV/hEnd感染成纤维细胞后18小时，经细胞裂解、提取后经FP-Western分析结果。
图6是人血管内皮生长抑制因子重组腺病毒对人血管内皮细胞生长的抑制作用实验一的曲线示意图。
图7是人血管内皮生长抑制因子重组腺病毒对人血管内皮细胞生长的抑制作用实验二的曲线示意图。
图8是人血管内皮生长抑制因子重组腺病毒对人血管内皮细胞生长的抑制作用实验三的曲线示意图。
图9是人血管内皮生长抑制因子重组腺病毒对人血管内皮细胞生长的抑制作用实验四的曲线示意图。
图10是对比分析后的Ad/hEndo对内皮细胞作用的效果图。
具体实施例以下通过实施例作进一步详细说明。实施例1如图2和图3所示，构建重组腺病毒1)根据已发表的胶原cDNA全序列，设计合成两段引物5’ATCGTCAACCTCAGGAC和3’TAGCACGATGTACCCGTGAT，以胶原cDNA为模版，经PCR方法扩增得人血管内皮生长抑制因子基因，其中，反应条件为第一循环94℃变性4分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟；以后各循环94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共25个循环。由此得到大量的Endostatin基因，用PAGE分析结果见图4所示，图4是RT-PCR产物分析图，A为分子量标记，B为Endostain基因。
2)将Cla1和EcoR1用连接酶连接到Endostatin的片断上，先连接Cla1，然后连接EcoR1，再用此酶切割Endostatin，同时用Cla1和EcoR1切割pUC19，将Endostatin连接到该质粒。
3)用Cla1和BamH1切割pUC19/Endo，同时用Cla1和BamH1切pQB1-AdCMV1形成pQB1-AdCMV/hEndo.
4)用纯化的pQB1-CMV/hEndo质粒与QB1-Viral DNA共转染BJ5183菌株，用0.2g pQB1-CMV/hEndo及8μgQB1-ViralDNA经4℃孵育30分钟，42℃热休克50秒钟，再在4℃孵育1分钟，加1ml SOC培养液1小时，将温育的SOC转入含安卞青霉素的琼脂培养板，24小时后，用灭菌牙签挑取单个细菌克隆，然后放入干净的含有LB的培养瓶，24小时后，按常规方法提取质粒，用Cla1和BanH1切割筛选。
5)将分离的阳性质粒经CsCl2纯化，经CaCl2方法转染293细胞。7天后，收集细胞，1000rpm离心15分钟，弃上清，细胞经37℃/-80℃冻融，裂解三次，4000rpm离心30分钟，取上清，弃沉淀，上清经二次感染，放大病毒，以同样方法裂解病毒，上清经CsCl2密度梯度离心，条件为4℃ 60000rpm16小时。经7号注射针头取AdCMV/hEndo分离带。用Spectra MW6000透析袋在N1H缓冲液中透析4小时，整个过程保持温度在4℃。取出病毒液，用0.25μm的滤膜过滤除菌，分装。于-80℃保存，一部分作空斑试验及病毒颗粒含量测定。实施例2人血管内皮细胞腺病毒功能鉴定经CsCl2纯化，效价及颗粒测定的病毒以不同浓度的pfu(5-30pfu)感染人成纤维细胞，然后进行细胞收集，细胞裂解，经Endostatin单克隆抗体于4℃吸附2小时，然后用蛋白A琼脂共沉淀，沉淀物经PBS洗涤3次后，加热到94℃，接着，用聚丙烯酰胺凝胶电泳3小时，再经抗Endostatin抗体与杂交膜反应12小时，进行X-射线放射自显影，结果如图5所示，图5是Ad/CMV/hEnd感染成纤维细胞后18小时，经细胞裂解，提取1/10作IP-Western分析的结果，胶浓度为8％。
用5-20pfu的Ad/CMV/hEndo分别感染人血管内皮细胞，在此同时进行细胞增殖率测定。感染8小时后，，测定其在450nm波长的光吸收值，据此可知人血管内皮细胞生长受到抑制，记录见下表。
不同浓度Ad/hEndo处理内皮细胞八小时后450nm波长光吸收值，其中CK为空白对照；VEC为内皮细胞；5pfu、10pfu、15pfu、20pfu代表不同浓度。
由上表数据经过方差分析得知Ad/Endo对内皮细胞的作用显著。
根据记率录作图，图6、图7、图8分别为在完全相同的条件下用Ad/hEndo感染内皮细胞的三次实验；图9为Ad/hEndo的载体即Ad-Mu在同等条件下进行的实验；图10为经过分析得出的Ad/hEndo对内皮细胞作用的效果图。实施例3人血管内皮生长抑制腺病毒活体内活性试验用1×108剂量对接种鼻咽癌的裸鼠进行抑癌试验，当肿瘤长到一定大小时，进行局部注射人血管内皮生长抑制腺病毒，2周后，肿瘤变小或完全消失。实验分二组治疗组和对照组，治疗组为5只裸鼠，分别注射等量Ad/Endo；对照组共4只裸鼠，其中二只注射Ad-WT，另二只注射DMEM，注射前各只裸鼠的具体情况如下
注射后2星期裸鼠情况
权利要求
1.一种病毒，其特征是该病毒含有序列为序列SEQ ID NO1的人血管内皮细胞生长抑制因子。
2.如权利要求1所述的病毒，该病毒为腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒。
3.如权利要求1所述的病毒，其特征在于该病毒是重组腺病毒，其中的人血管内皮细胞生长抑制因子结构基因DNA序列为序列SEQ ID NO1。
4.如权利要求1至3所述的任一病毒，其特征是该病毒能在真核生物中表达。
5.如权利要求1至3所述的任一含有序列SEQ ID NO1的人血管内皮细胞生长抑制因子的病毒载体。
6.一种真核表达系统，其特征在于含有如权利要求4所述的含有人血管内皮细胞生长抑制因子的任何病毒。
7.一种制备人血管内皮细胞生长抑制因子重组腺病毒的方法，利用腺病毒顺式活化序列、LTR(长末端重复区)序列组成的重组病毒，并由CMV(cytomegalovirus；细胞病毒)启动子操纵内皮细胞生长抑制因子，其特征是以特异性引物，以胶原cDNA为模板，用PCR方法扩增得到人血管内皮细胞生长抑制因子，并联接到腺病毒E1区组建成的人血管内皮细胞生长抑制因子腺病毒。
8.一种利用权利要求2或3的任一的腺病毒或腺病毒相关病毒或逆转录病毒携带基因制备人血管内皮细胞生长抑制因子的方法，先将毒株转染到细胞培养，浓缩纯化人血管内皮细胞生长抑制因子腺病毒株、逆转录病毒株并制备成的人血管内皮细胞生长抑制因子腺病毒产品。
9.如权利要求8所述的制备人血管内皮细胞生长抑制因子的方法，其特征在于所用的细胞为293细胞。
10.一种抗肿瘤的药物组合物，其特特征在于含有如权利要求2至4所述的任一重组载体。
11.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于含有如权利要求7所述的真核表达系。
全文摘要
一种重组腺病毒,使得人血管内皮细胞抑制因子(Endostatin)与腺病毒连接后可直接在真核细胞中表达。利用Endostatin抑制血管内皮细胞生长的特点,将其克隆到腺病毒E1缺陷株,使腺病毒特异性地将Endostatin带入肿瘤组织,抑制肿瘤周边及肿瘤实体内血管生成,从而使肿瘤产生无营养状态而凋亡,避免了在体外制备蛋白质过程中由于原核细胞表达产物无糖基化和磷酸化修饰而活性不高、提取纯化过程导致蛋白质活性下降等不利因素的影响。
文档编号C12N15/86GK1366040SQ0112789
公开日2002年8月28日 申请日期2001年9月27日 优先权日2001年9月27日
发明者黄文林 申请人:黄文林