专利名称：：一种微藻培养方法及其光生物反应器系统的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微藻养殖领域，具体而言，涉及一种用新型光生物反应器系统来培养微藻的方法以及所述方法中使用的新型光生物反应器系统。
背景技术：
：在当前资源和环境面临双重危机的情况下，找到一种高效的可再生资源的同时实现C02减排就变得尤为重要。微藻是光合效率最高的原始植物之一，与农作物相比，单位面积的产率可高出数十倍。且微藻富含大量蛋白质、多糖、色素等活性物质，可以广泛应用于饲料、食品、医药保健品、化妆品、可再生燃料等领域。进入21世纪以后，石油价格快速飙升，对微藻的研究迅速成为一个热点，微藻生物柴油技术也取得了长足的进步。在美国、澳洲、日本、西欧、印度和南非，无论是政府还是企业，都投入大量资金来进行产油微藻的开发。在微藻的规模化培养中，传统方法有人工控制光照、温度、相对无菌条件等，但成本均较高。这些方法中采用较多的是控制光照。现有的光照控制技术，有的采用添加内置人工光源补光，但要求使用防水材料，成本较高；有的采用外置的单排或双排光照，但是占地面积大，且光照利用率偏低。这些限制因素大大降低了生物柴油的市场竞争力。微藻高效培养首先要有一个高效的光生物反应器；其次，藻种要抗逆性较强、生长速率高、总脂含量高。符合上述条件的微藻藻种，主要有小球藻、硅藻、栅藻等。一般采用两步培养法第一步，在指数培养期保证最佳的生长条件和营养条件，让其生物量快速累积；第二步，在指数末期和稳定期前期开始转化培养条件，从而在体内积累油脂或色素等物质。与本发明最相近的实现方案为CN200410017249.X，该发明选用的是多级气升式反应器，在第一级反应器中添加培养液，通过重力作用来转移藻液，并添加了一个人工光源，创造较佳条件，可以生产大量的对数生长期的高活性的藻种。但该发明的技术方案没有补光系统，因而很难保证一级反应器中的微藻快速生长，且反应器较多，反应器之间的液液输送繁琐，能耗较大。
发明内容本发明针对微藻的规模化培养中，高密度培养和产品的快速累积一直制约规模化培养的问题，提供了一种新型的微藻光生物反应器系统及采用该反应器系统的培养工艺。本发明为微藻的规模化培养提供了新的工艺和装置。—方面，本发明提供一种培养藻种的方法，所述方法包括下列步骤(a)在一级反应器中将对数期的藻液进行半连续培养；(b)将步骤(a)中收获的藻液在二级反应器中继续进行藻的对数期和稳定期生长；(c)对步骤(b)中得到的藻液进行浓縮，然后在三级反应器中补入缺氮的培养基中进行氮胁迫。在一个实施方案中，一级反应器为柱式反应器，其中心位置为空心，空心处设置有人工光源。在一个实施方案中，二级反应器为空心的柱式反应器。在一个实施方案中，一级反应器和二级反应器呈同心圆分布，二级反应器内径大于一级反应器内径。在一个实施方案中，二级反应器和一级反应器的体积比为8-6:i。在一个实施方案中，三级反应器为开放式反应器。在一个实施方案中，所述三级反应器为跑道形状的反应器。在一个实施方案中，在一级反应器中进行半连续培养，每天补入30-50%的新鲜培养液，并收集30_50%的藻液，其中30-50%的量通过一级反应器中初始藻液和剩余藻液的高度差来实现。在一个实施方案中，在一级反应器的培养过程中，同时通入C02，调节pH值，并补充生长所需的碳源。在一个实施方案中，藻液在二级反应器中培养3-5天。在一个实施方案中，藻液从一级反应器到二级反应器的转移是通过三通在重力的作用下进行的。在一个实施方案中，转移藻液的量是通过初始藻液和剩余藻液的高度差来实现的。在一个实施方案中，所述的藻为小球藻、硅藻或栅藻。在一个实施方案中，所用的藻为牟氏角毛藻或荒漠栅列藻。在一个实施方案中，其中所述人工光源在培养过程中连续打开，或根据接种的藻株和藻液的浓度差异选择部分或全部将人工光源关闭。在一个实施方案中，在一级反应器的接种初期，将人工光源全部关闭，单纯依靠自然光生长；在接种的3-6小时后，部分打开人工光源；在接种7-10小时后，全部打开人工光源。另一方面，本发明提供一种光生物反应器系统，如图1和图3所显示，所述光生物反应器系统包括一级反应器和二级反应器，其中一级反应器为柱式反应器，其中心位置为空心，空心处设置有人工光源，二级反应器也为空心的柱式反应器，一级反应器和二级反应器呈同心圆分布，一级反应器和二级反应器通过三通连接，其中二级反应器内径大于一级反应器外径。在一个实施方案中，所述光生物反应器系统还包括独立设置的三级反应器。在一个实施方案中，所述三级反应器为开放式反应器。在一个实施方案中，所述三级反应器为跑道形状的反应器。在一个实施方案中，所述一级反应器的内径为50-70mm，外径为内径+(10-20mm)，二级反应器的内径为一级反应器的外径+10mm，外径为二级反应器的内径+(50-100咖)。在一个实施方案中，二级反应器和一级反应器的体积比为8-6:1。在一个实施方案中，人工光源、一级反应器和二级反应器之间的高度顺序为人工光源>一级反应器>二级反应器，一级反应器和二级反应器的高度差异，可以避免光遮挡，最大限度地利用自然光和人工光源。在一个实施方案中，所述一级反应器的中心位置设置有人工光源，所述人工光源为多个排列为圆束状的灯管。在一个实施方案中，其中所述人工光源可以根据微藻的细胞密度来调节光照强度。在一个实施方案中，所述人工光源在培养过程中连续打开或根据接种的藻株和藻液的浓度差异选择部分或全部将人工光源关闭。在一个实施方案中，在一级反应器的接种初期，将人工光源全部关闭，单纯依靠自然光生长；在接种的3-6小时后，部分打开人工光源；在接种7-10小时后，全部打开人工光源，这样能达到人工光源的最有效地利用，同时也节约成本。在一个实施方案中，其中一级反应器采用易透光的玻璃材质，这样既可以清洗方便，又能够充分地透光，让二级反应器也接受部分人工光源，促进细胞生长。i亥反应器的主要优势力:(1)—级反应器的中空处添加一独立的人工光源，该人工光源既能达到反应器内置光源的效果，防止中心处因光源衰减而造成光强不足，同时因为是独立放置，人工光源材料可选用一般材料，成本比使用防水材料的反应器内置光源低很多。(2)该人工光源可以根据藻细胞的浓度，调节光照强度。当藻细胞浓度很低，在接种初期，可将人工光源全部或部分关闭。(3)—级反应器中，实行半连续培养，从而保证微藻始终处于对数生长期，生物量积累迅速。(4)—级反应器和二级反应器的高度差异，可以使光线得到最大限度地利用。既可以使一级反应器接受部分自然光，同时，一级反应器的人工光源也可以透过反应器而照射到二级反应器中，从而促进二级反应器中的藻细胞生长。(5)藻液从一级反应器到二级反应器的转移是通过三通在重力的作用下进行的，操作简单方便，节省能耗。具体而言，整个发明如图4所示，在一级反应器中实现半连续培养，每天补入30-50%的新鲜培养液，并收集30-50%的藻液，其中30-50%的量是通过一级反应器中初始藻液和剩余藻液的高度差来实现的，这样可以保证微藻一直处于对数生长期，生长速度在l-3倍/天。另外，在培养过程中，由于细胞生长较迅速，从而使pH值上升很快，在此同时通入(A，调节pH值，以保持最佳生长pH环境，并补充生长所需的碳源。将收获的藻液加入到二级反应器中，以实现藻的对数期和稳定期的生长，培养3-5天，对藻液进行浓縮，然后补入缺氮的培养液，将其放入三级反应器中，三级反应器可选择板式或跑道池等开放式反应器，本发明选用的是敞开式的跑道池反应器，这样受光面积大，可以最大限度地利用自然光，促进油脂的快速累积。本发B月与现,有技术相比的优势1.本发明在三步法培养微藻的不同阶段采用不同的光生物反应器，每一阶段反应器的设计都合理地考虑到了该阶段的微藻最佳培养条件，以实现高密度培养和产品快速积累。2.本发明采用三步培养法，细胞生长和产品累积相结合。充分利用微藻在对数时期生长较快的优点，通过间歇式地补充营养液，创造连续的对数生长期，可以快速有效实现生物量的积累。再次，在对数末期辅以氮胁迫，来保证产物地快速转化，减少了污染几率，且完全依靠自然光照等，经济可行。3.本发明采用一种新型的光生物反应器系统，可以实现藻种培育和微藻扩养相结合，操作简单。4.本发明，将补光系统圆束状排列，与反应器结构相似，可以最大限度地利用人工光源，且与普通的内置人工光源效果相近，但无需防水材料，大大地降低成本。5.在一级培养和二级培养之间，靠三通在重力作用下进行藻液转移，节约能耗，降低成本。6.选择硅藻类的牟氏角毛藻，其生长快、温度适用性广、细胞内油脂含量高，很适合用来制备液态燃料或油脂。7.本发明一级培养用半连续培养法，夜间补光，使细胞维持在对数生长期，藻种优良。8.本发明通过浓縮藻液和重新补加缺氮培养液相结合，既可以在产品转化期，保证细胞微生长，同时又能消耗掉残余的氮源，可以大大縮短转化时间，同时也降低了污染几率。图1:为本发明的光生物反应器系统中的一级反应器和二级反应器1为放置人工光源区，2为一级反应器区，3为二级反应器区。图2:为一级反应器中所使用的人工光源分布图。选的灯管为T8，长度为120cm，功率为36瓦，是培养微藻的专用灯管。将其多个排列为圆束状，可以使反应器最大限度地利用该人工光源。图3:为图1的平视图1为一级反应器，2为二级反应器，3为人工光源区，4为三通转移区。从一级反应器到二级反应器，藻液的转移，是通过三通在重力的作用下进入到二级反应器的，转移体积是通过一级反应器初始藻液和剩余藻液的高度差来调节的，具体情况见图3，在一级反应器中，首先将培养体系接种到高度A处，将培养藻液放出到刻度线B处时，即为30%的量，同理，将培养藻液放出到刻度线(:处时，即为50%。图4:为用本发明的培养方法培养藻液的培养流程图。图5:为一级反应器半连续培养与传统培养的牟氏角毛藻的生长曲线比对图。图6:用本发明方法培养与传统培养法得到的牟氏角毛藻的总脂含量对照图。图7:为一级反应器半连续培养与传统培养的荒漠栅列藻的生长曲线比对图。图8:跑道形状反应器的俯视图。跑道形状反应器通过搅拌转子实现藻液流动。实施例1三歩培养法和氮月办迫.在牟氏角丰,藻鬼养中的应用。本发明所用的培养液配方改良的f/2培养液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>缺氮培养液配方NaH2P04.2H205.66mg/L，Na2HP045.15mg/L，FeCl3.6H203.162mg/L，Na2.EDTA3.419mg/L，海水晶为30mg/L。牟氏角毛藻(Chaetocerosmualleri)(FACHB-862)购自武汉中科院水生所。将所述牟氏角毛藻接入到一级反应器中，用改良的f/2培养液，接种对数生长期的藻液(接种的比率为3:l)，初始OD，为0.512。在前3个小时，人工光源全部关闭，在4-7个小时，人工光源开启一半，剩余时间连续光照下培养，光照为本发明设计的灯束，连续光照，光强为126士10umol/(m2.s)，培养温度为25±5°C。从一级反应器的底部通过曝气头通入空气和C02的混合气体，通气量为2.5L/min，C02的百分含量为5%，连续培养时间为11天。具体的生长情况见图5。在一级反应器中，采用半连续培养，通过监测750nm下0D值，可以看出藻细胞的生物量可以每天倍增1-3倍，是传统培养的2.133倍。藻细胞的浓度达到750nm吸光度为1.0_1.5时，将三通打开，在重力的作用下，30-50%的藻液流入二级反应器，然后在独立的潜水泵的作用下，将同体积的改良的f/2培养液放进一级反应器中。如上所述，通过图3中的4三通，在重力的作用下，将一级反应器中的藻液，接种到二级反应器中，二级反应器的培养液依然为改良的f/2，光照为自然光和透过一级反应器通过的人工光源，温度、通气量、(A含量同一级反应。在二级反应器培养4天后，通过过滤浓縮，培养液体积浓縮为原体积的50%，将得到的藻液全部放入跑道池反应器(即三级反应器)中，并加入原体积1/2的缺氮培养基，进行氮胁迫，温度为30士1(TC，光照为人工光源，并通过螺旋桨进行搅拌，从而实现快速累积。在三级反应器中，牟氏角毛藻培养了2天后，通过差重法测定总脂含量，氮胁迫组总脂含量为14.38%比对照组6.63%增加2.169倍，在三级反应器中培养4天，氮胁迫组总脂含量达到29.84%。具体结果见图6。差重法取一定体积的藻液，5000r/min离心5min，再用灭过菌的清水清洗3次，经冷冻干燥后，用珠磨机破壁5min，采用氯仿甲醇提取法得出各微藻中总肪含量。计算公式为X=(M「M。)/M2X100%其中X:干藻粉中总脂的含量，％;Mi:玻璃瓶和总脂的质量，g;M。玻璃瓶的质量，g;M2:干藻粉的质量，g实施例2H歩培养法和氮胁迫.在荒澄栅列藻鬼养中的应用。荒漠栅列藻(Scenedesmusdeserticola)购自暨南大学。将所述荒漠栅列藻接入到一级反应器中，用BG11培养基，接种对数生长期的藻液(接种的比率为5:l)，初始OD，为0.583。在连续光照下培养，光照为本发明设计的灯束，光强为126士10umol/(m2.s)，培养温度为25±5°C。从一级反应器的底部通过曝气头通入空气和C02的混合气体，通气量为2.5L/min，C02的百分含量为5X，连续培养时间为10天。具体的生长情况见图7。在一级反应器中，采用半连续培养，通过监测750nm下OD值，可以看出藻细胞的生物量可以每天倍增1-3倍，是传统培养的1.754倍。藻细胞的浓度达到750nm吸光度为1.0_2.0时，将三通打开，在重力的作用下，将50%的藻液流入二级反应器，然后在独立的潜水泵的作用下，将同体积的BG11培养液放进一级反应器中。如上所述，通过图3中的4三通，在重力的作用下，将一级反应器中的藻液，接种到二级反应器中，二级反应器的培养液依然为BG11，光照为自然光和透过一级反应器的人工光源，温度、通气量、(A含量同一级反应。在二级反应器培养5天后，通过过滤浓縮(培养液体积浓縮为原体积的50%)，将得到的藻液全部放入跑道池反应器(即三级反应器)中，并加入原体积1/2的缺氮BG11培养基，进行氮胁迫，温度为30士1(TC，光照为自然光，并通过螺旋桨进行搅拌，从而实现快速累积。在三级反应器中，荒漠栅列藻培养了7天后，通过差重法测定总脂含量，氮胁迫组总脂含量为35.43%比对照组16.035%增加2.21倍。BG11培养基的配方如下表9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求一种微藻培养方法，所述方法包括下列步骤(a)在一级反应器中将对数期的藻液进行半连续培养；(b)将步骤(a)中收获的藻液在二级反应器中继续进行藻的对数期和稳定期生长；(c)对步骤(b)中得到的藻液进行浓缩，然后在三级反应器中补入缺氮的培养基进行氮胁迫。2.权利要求l的方法，其中所述一级反应器为柱式反应器，其中心位置为空心，空心处设置有人工光源。3.权利要求1的方法，其中所述二级反应器为空心的柱式反应器。4.权利要求2或3的方法，其中所述一级反应器和二级反应器呈同心圆分布，二级反应器内径大于一级反应器外径。5.权利要求4的方法，其中二级反应器和一级反应器的体积比为8-6:1。6.权利要求1的方法，其中所述三级反应器为开放式反应器。7.权利要求6的方法，其中所述三级反应器为跑道形状。8.权利要求l的方法，在一级反应器中进行半连续培养，每天补入30-50%的新鲜培养液，并收集30-50%的藻液。9.权利要求8的方法，其中30-50%的量是通过一级反应器中初始藻液和剩余藻液的高度差来实现的。10.权利要求1或8的方法，其中在一级反应器的培养过程中，同时通入C(^，调节pH值，并补充生长所需的碳源。11.权利要求2的方法，其中将藻液在二级反应器中培养3-5天。12.权利要求1或5的方法，其中藻液从一级反应器到二级反应器的转移是通过三通在重力的作用下进行的。13.权利要求2的方法，其中所述人工光源在培养过程中连续打开，，或根据接种的藻株和藻液的浓度差异选择部分或全部将人工光源关闭。14.权利要求1、2、3、5、6、7、8、9或11的方法，所述藻选自小球藻、硅藻或栅藻。15.权利要求14的方法，所述藻选自牟氏角毛藻或荒漠栅列藻。16.—种用于权利要求l-15任一项的方法的光生物反应器系统，包括一级反应器和二级反应器，其特征在于一级反应器为柱式反应器，其中心位置为空心的，空心处设置有人工光源，二级反应器为空心的柱式反应器，一级反应器和二级反应器呈同心圆分布，一级反应器和二级反应器通过三通连接，其中二级反应器内径大于一级反应器外径。17.权利要求16的光生物反应器系统，还包括独立设置的三级反应器。18.权利要求17的光生物反应器系统，其中所述三级反应器为跑道形状的三级反应器。19.权利要求16-18任一项的光生物反应器系统，其中所述二级反应器和所述一级反应器的体积比为8-6:1。20.权利要求16-18任一项的光生物反应器系统，其中所述人工光源、一级反应器和二级反应器之间的高度顺序为人工光源>一级反应器>二级反应器。21.权利要求16-18任一项的光生物反应器系统，所述人工光源为多个排列为圆束状的灯管。22.权利要求21的光生物反应器系统，其中所述人工光源根据微藻的细胞密度来调节光照强度。一23.权利要求16-18任一项、或权利要求22的光生物反应器系统，其中一级反应器采用易透光的玻璃材质。全文摘要本发明提供一种培养微藻的新式的光生物反应器系统，以及用所述光生物反应器系统培养微藻的方法。本发明在培养微藻的不同阶段采用不同的光生物反应器，每一阶段反应器的设计都合理地考虑到了该阶段的微藻最佳培养条件，以实现微藻的高密度培养和产品快速积累，从而为微藻的规模化养殖提供新的工艺和装置。文档编号C12N1/12GK101696389SQ200910207918公开日2010年4月21日申请日期2009年10月29日优先权日2009年10月29日发明者刘敏胜,张蕊,李静,韩春梅申请人:新奥科技发展有限公司;