一株模仿葡萄球菌BP10及其在发酵香肠中的应用的制作方法

本发明涉及一株模仿葡萄球菌bp10，具体涉及一株可改善发酵香肠品质的模仿葡萄球菌bp10及其在发酵香肠中的应用。

背景技术：

发酵香肠是一种传统肉制品，是指将绞碎的肉同糖、盐和发酵剂等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有稳定微生物特性和典型发酵香味的肉制品。我国传统发酵香肠以自然发酵为主，发酵周期长达8-10个月，生产成本高；没有明确的技术指标，食品安全质量得不到保证；而且传统发酵香肠还有着含盐量高,易氧化酸败，以及存在有害微生物等问题。在传统发酵香肠现代化研究中,风味和安全性是影响发酵香肠发展的关键因素。所以需要研发兼顾风味佳和安全性好的发酵香肠发酵剂。

技术实现要素：

本发明的目的是提供改善发酵香肠的风味和安全性的模仿葡萄球菌bp10，本发明还公开了模仿葡萄球菌bp10的菌悬液以及模仿葡萄球菌bp10在发酵香肠中的应用。

为实现上述目的，本发明提供了一株模仿葡萄球菌bp10，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16592。

本发明还提供了一种模仿葡萄球菌bp10菌悬液，所述菌悬液是采用所述模仿葡萄球菌bp10制备的。

进一步地，所述模仿葡萄球菌bp10的菌悬液的制备方法为：

（1）将所述模仿葡萄球菌bp10接种到lb培养基中，所述模仿葡萄球菌bp10接种到lb培养基中的浓度为10⁷cfu/ml，在37℃、150r/min下培养16h；

（2）将步骤（1）得到的发酵液，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的菌体沉淀，然后在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将步骤（4）得到的菌体沉淀加入无菌水，所述无菌水的加入量为步骤（2）所用发酵液体积的1/10倍。

进一步地，本发明中所涉及的无菌水为蒸馏水经121℃灭菌20min。

步骤（1）中的所述lb培养基包括胰蛋白胨10g/l,氯化钠10g/l,酵母浸粉5g/l,ph7.0，121℃灭菌20min；

本发明还保护所述的模仿葡萄球菌bp10在发酵香肠中的应用。

本发明还提供了一种香肠发酵剂，所述发酵剂包含所述模仿葡萄球菌bp10或模仿葡萄球菌bp10菌悬液。

进一步地，还包括植物乳杆菌b-2或植物乳杆菌b-2菌悬液。

所述植物乳杆菌b-2菌悬液的制备方法为：

（1）将植物乳杆菌b-2接种到mrs培养基中，所述植物乳杆菌b-2接种到mrs培养基中的浓度为10⁷cfu/ml，在37℃、静置培养16h；

所述mrs培养基包括：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、葡萄糖20g/l、吐温801ml/l、乙酸钠5g/l、磷酸氢二钾2g/l、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.25g/l，ph6.5~7.0，121℃灭菌20min;

（2）将步骤（1）得到的发酵液，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的菌体沉淀，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将步骤（4）得到的菌体沉淀加入无菌水，所述无菌水的加入量为步骤（2）所用发酵液体积的1/10倍。

进一步地，所述植物乳杆菌b-2菌悬液和模仿葡萄球菌bp10菌悬液的体积比为3：1。

所述模仿葡萄球菌bp10菌悬液中模仿葡萄球菌bp10的最终浓度不低于10⁹cfu/ml；所述植物乳杆菌b-2菌悬液中植物乳杆菌b-2的最终浓度不低于10⁹cfu/ml。

本发明积极效果如下：

将本发明模仿葡萄球菌bp10制成菌悬液后和植物乳杆菌b-2菌悬液复配制备双菌种发酵剂生产发酵香肠，香味浓郁，感官品质优于自然发酵香肠，并且生产周期短，同时能够有效抑制有害微生物生长繁殖，抑制脂肪氧化，可在一定程度上延长香肠的保质期，质量安全、稳定。利用本发酵剂生产发酵香肠可以大大降低汁液流失率，提高出品率，改善口感。

附图说明

图1菌株pb10个体形态。

图2为四组发酵香肠样品的感官评价结果。

图3为四组发酵香肠样品的tba值检测结果。

图4为四组发酵香肠样品的汁液流失率值测定结果。

具体实施方式

本发明提供了一株模仿葡萄球菌bp10，已于2018年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101），保藏编号为cgmccno.16592。staphylococcussimulanspb10即模仿葡萄球菌bp10。

本发明还提供了一种模仿葡萄球菌bp10菌悬液，所述菌悬液是采用上述保藏的模仿葡萄球菌bp10制备的。

进一步地，所述模仿葡萄球菌bp10的菌悬液的制备方法为：

（1）将所述模仿葡萄球菌bp10接种到lb培养基中，所述模仿葡萄球菌bp10接种到lb培养基中的浓度为10⁷cfu/ml，在37℃、150r/min下培养16h，得到发酵液；

（2）将步骤（1）得到的发酵液，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（3）然后用无菌水洗涤步骤（2）得到的菌体沉淀，然后在4℃、8000r/min离心2min收集菌体沉淀；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将步骤（4）得到的菌体沉淀加入无菌水，所述无菌水的加入量为步骤（2）所用发酵液体积的1/10倍。

本发明所述的无菌水均为蒸馏水经121℃灭菌20min。

本发明步骤（1）中的所述lb培养基包括胰蛋白胨10g/l,氯化钠10g/l,酵母浸粉5g/l,ph7.0，121℃灭菌20min；

本发明还提供了上述模仿葡萄球菌bp10在发酵香肠中的应用，经过测试可以得出，得到的发酵香肠香味浓郁，质量安全稳定，货架期长。本发明将模仿葡萄球菌bp10按照上述方法制得菌悬液，然后应用到发酵香肠中。

本发明一种香肠发酵剂还提供了一种香肠发酵剂，所述发酵剂中包含上述的模仿葡萄球菌bp10或上述的模仿葡萄球菌bp10菌悬液。

进一步地，所述发酵剂中还包含植物乳杆菌b-2或植物乳杆菌b-2菌悬液，所述植物乳杆菌b-2菌悬液的制备方法为：

（1）将植物乳杆菌b-2接种到mrs培养基中，所述植物乳杆菌b-2接种到mrs培养基中的浓度为10⁷cfu/ml，在37℃、静置培养16h，得到发酵液；

（2）将步骤（1）得到的发酵液，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的菌体沉淀，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将步骤（4）得到的菌体沉淀加入无菌水，所述无菌水的加入量为步骤（2）所用发酵液体积的1/10倍。

本发明提供了一种香肠发酵剂，所述香肠发酵剂中将植物乳杆菌b-2和模仿葡萄球菌bp10复配，制备双菌种复合发酵剂，所述植物乳杆菌b-2菌悬液和模仿葡萄球菌bp10菌悬液的体积比为3：1。

本发明提供的双菌种复合发酵剂安全无毒，兼具抑菌、增香功能，通过添加该双菌种复合发酵剂可提高发酵香肠产品质量，增强产品香味，改善发酵香肠组织状态，缩短发酵周期，防止发酵香肠的腐败变质，显著延长产品的货架期，提高发酵香肠的安全性。用该双菌种复合发酵剂制备发酵香肠，具有广阔的应用前景。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

猪前臀尖肉：北国超市天河店。

实施例1模仿葡萄球菌bp10的获得

一、菌种筛选

1、称取传统发酵肉制品，选自广味腊肠、四川腊肉、江苏华洋腊肉、自制腊肠、皇上皇、秋之风、金华、金煌腊肠中的任意一种称取25g，加入到225ml的无菌生理盐水中，用无菌生理盐水10倍梯度稀释后分别取200μl稀释液涂布于msa培养基平板上，37℃静置培养24h。

2、完成步骤1后，从msa培养基平板上挑取单菌落，反复多次划线纯化。

3、对步骤2纯化的菌株进行筛选，通过耐亚硝酸实验、硝酸盐还原能力检测、产粘液实验，血浆凝固酶实验、溶血实验、脱羧实验以及脱氧核糖核酸酶的检测，进一步筛选得到一株有良好的亚硝酸盐耐受性、硝酸盐还原实验阳性、不产粘液，硝酸盐还原酶活力强、血浆凝固酶实验阴性、溶血实验阴性、脱羧实验阴性以及脱氧核糖核酸酶阴性的菌株，将其命名为菌株bp10。

二、菌株bp10的形态鉴定及分子鉴定

1、本发明的保藏编号为cgmccno.16592的菌株bp10的个体形态为：革兰氏染色阳性，球形，葡萄状排列，见图1。

菌落形态：圆形、白色菌落，表面光滑，菌落直径约1mm。

综合以上鉴定，根据《常用细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏系统细菌学手册》可知，初步将pb10鉴定为葡萄球菌属细菌。

将菌株bp10的16srdna序列进行扩增并测序，测序结果如序列表seqidno.1所示。16srdna鉴定结果显示菌株bp10与ncbi数据库中的多株模仿葡萄球菌的相似性为99%。

经过以上鉴定，可以确定菌株bp10属于模仿葡萄球菌，因此重新将其命名。

实施例2、发酵香肠的制备及效果评价

一、植物乳杆菌b-2菌悬液的制备

（1）将植物乳杆菌b-2接种到mrs培养基中，所述植物乳杆菌b-2接种到mrs培养基中的浓度为10⁷cfu/ml，在37℃、静置培养16h；

（2）将步骤（1）得到的发酵液，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（3）用无菌水洗涤步骤（2）得到的菌体沉淀，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将步骤（4）得到的菌体沉淀加入无菌水，所述无菌水的加入量为步骤（2）所用发酵液体积的1/10倍。

二、模仿葡萄球菌bp10菌悬液的制备

（1）将所述模仿葡萄球菌bp10接种到lb培养基中，所述模仿葡萄球菌bp10接种到lb培养基中的浓度为10⁷cfu/ml；在37℃、150r/min下培养16h；

（2）将步骤（1）得到的发酵液，在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（3）然后用无菌水洗涤步骤（2）得到的菌体沉淀，然后在4℃、8000r/min离心2min，收集菌体沉淀；

（4）重复步骤（3）一次；

（5）将步骤（4）得到的菌体沉淀加入无菌水，所述无菌水的加入量为步骤（2）所用发酵液体积的1/10倍。

三、本发明还提供了一种香肠发酵剂，所述植物乳杆菌b-2菌悬液和模仿葡萄球菌bp10菌悬液的体积比为3：1。所述模仿葡萄球菌bp10菌悬液中模仿葡萄球菌bp10的最终浓度不低于10⁹cfu/ml；所述植物乳杆菌b-2菌悬液中植物乳杆菌b-2的最终浓度不低于10⁹cfu/ml。

植物乳杆菌b-2菌悬液和模仿葡萄球菌bp10菌悬液的制备按照上述一和二方法制得。

三、发酵香肠的制备

1、原料肉的预处理

从超市购买新鲜猪前臀尖肉（宰后24-48小时），按照肥瘦比例1:4（w/w）搅碎混匀，得到肉馅，放置于冰箱冷藏备用。

2、拌料

将1.5%食盐、1.5%白砂糖、0.3%味精、0.2%护色剂（亚硝酸钠及曲红素混合品）混于水中（所用水量与肉馅质量的比值为1:10（w/w）），加入到混匀的肉馅中再次混合均匀，最后将得到的肉馅平均分为四份。

3、接种

设置四个接种组，一个接种组与上述肉馅中的一份混合均匀。每个接种组设置三个重复。

（1）将上述实施例2制得的香肠发酵剂与肉馅混合均匀，所述香肠发酵剂即植物乳杆菌b-2菌悬液和模仿葡萄球菌bp10菌悬液的体积比为3：1；制得的接种产品记为“模仿葡萄球菌+植物乳杆菌”组。

（2）将上述实施例2制得的植物乳杆菌b-2菌悬液与肉馅混合均匀，制得的接种产品记为“植物乳杆菌”组；

（3）将上述实施例2制得的模仿葡萄球菌bp10菌悬液与肉馅混合制得的接种产品记为“模仿葡萄球菌”组。

（4）用无菌水与肉馅混合制得的接种产品记为“空白”组。

以上三组分别按照1ml菌悬液/100g肉的比例制备。第四组为1ml无菌水/100g肉的比例制备。

4、灌肠

将接种后的肉馅灌至猪肠衣中，制成10cm长，直径4cm的肉肠，两头用棉绳扎紧。

5、发酵

将制好的肉肠放置在37℃培养箱中发酵72小时。

6、贮藏

72小时后取出发酵香肠置于常温贮藏。

四、发酵香肠的效果评价

分别在发酵完成后的0、2、4、6、8天时取发酵香肠样品，放锅里蒸煮5min后，进行如下检测：

（1）感官评价

参照gb/t22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》对肉样进行感官评定，评价指标包括气味、色泽、组织状态、滋味等。发酵香肠感官评价标准见表1所示。将上述四个接种组分别制得的发酵香肠按照表1的标准进行测试，评价测试结果见图2。

表1发酵香肠感官评价标准

由图2可知加入悬菌液的三个接种组的感官评价分数显著高于空白组，第11天，“模仿葡萄球菌+植物乳杆菌”组感官评分为26.93，而空白组感官评分仅为22.67分，这说明植物乳杆菌b-2和模仿葡萄球菌bp10双菌种发酵剂能够改善发酵香肠的感官品质。与空白对照组和接种单一菌种发酵剂组相比，接种双菌种发酵剂组发酵香肠色泽更加鲜亮，切面肉馅更加紧致，香味更加浓郁，后味饱满。

空白对照组和接种单一菌种发酵剂组也就是空白对照组和模仿葡萄球菌组对比，以及空白对照组和植物乳杆菌组对比，可以看出，用本发明发明的模仿葡萄球菌bp10菌悬液或植物乳杆菌b-2菌悬液作为发酵剂制得的发酵香肠，虽然感官评价分数低于双菌种发酵剂组，但是仍高于空白对照组，说明模仿葡萄球菌bp10菌悬液或植物乳杆菌b-2菌悬液单一的菌悬液也可以产生较好的效果，获得具有较好感官评价的发酵香肠。

“模仿葡萄球菌+植物乳杆菌”组优于模仿葡萄球菌组和植物乳杆菌组，说明复配后效果更佳。

（2）测定发酵香肠硫代巴比妥酸值（tbars）。测定方法参照参考文献“朱志远，卢士玲，孙晓斌，等.发酵剂对发酵香肠微生物和理化品质的影响［j］.江苏农业学报，2009，25(4):890-893.”。结果见图3。结果表明，在整个发酵及贮藏过程中，双菌种发酵剂接种组的tba值显著低于空白组、模仿葡萄球菌组和植物乳杆菌组，第11天，接种双菌种发酵剂组硫代巴比妥酸值为0.8884mg/100g，而对照组则为1.3536mg/100g，这说明接种双菌种发酵剂更能够抑制发酵肠中脂肪的氧化，更有利于保持发酵香肠的品质，延长其货架期。

空白对照组和接种单一菌种发酵剂组也就是空白对照组和模仿葡萄球菌组对比以及空白对照组和植物乳杆菌组对比，可以看出，模仿葡萄球菌组或植物乳杆菌组虽然tba值高于双菌种发酵剂组，但是仍低于空白对照组，说明本发明发明的模仿葡萄球菌bp10菌悬液或植物乳杆菌b-2菌悬液单一的菌悬液作为发酵剂也可以产生较好的效果，能够抑制发酵肠中脂肪的氧化，模仿葡萄球菌bp10和植物乳杆菌b-2复配后形成的双菌种发酵剂组优于模仿葡萄球菌组或植物乳杆菌组，说明复配后效果更佳，具有更加优良的抑制脂肪氧化的能力，更有利于保持发酵香肠的品质，延长其货架期。

（3）测定肉样汁液流失率。汁液流失率的测定方法参照文献“luf,liudh,yexq,etal.alginate-calciumcoatingincorporatingnisinandedtamaintainsthequalityoffreshnorthernsnakehead(channaargus)filletsstoredat4°c.journalofthescienceoffood&agriculture,2009,89(89):848-854.”。结果见图4。结果表明，“模仿葡萄球菌+植物乳杆菌”组的汁液损失要显著低于空白组、模仿葡萄球菌组和植物乳杆菌组，第11天，接种双菌种发酵剂组汁液流失率为36.88%，而空白对照组的汁液流失率则高达44.37%，这说明接种双菌种发酵剂能够更好地抑制发酵香肠的汁液流失，提高了发酵香肠的持水性，提高出品率。

空白对照组和接种单一菌种发酵剂组也就是空白对照组和模仿葡萄球菌组对比以及空白对照组和植物乳杆菌组对比，可以看出，用模仿葡萄球菌bp10菌悬液或植物乳杆菌b-2菌悬液作为发酵剂制得的发酵香肠，虽然汁液损失高于双菌种发酵剂组，但是仍低于空白对照组，说明本发明模仿葡萄球菌bp10菌悬液或植物乳杆菌b-2菌悬液单一的菌悬液作为发酵剂也可以产生较好的效果，能够抑制发酵香肠的汁液流失。“模仿葡萄球菌+植物乳杆菌”组的汁液损失要显著低于空白组、模仿葡萄球菌组和植物乳杆菌组，说明复配后效果更佳，能够更好地抑制发酵香肠的汁液流失，提高了发酵香肠的持水性，提高出品率。

综上，本发明应用模仿葡萄球菌-植物乳杆菌双菌种发酵剂改善发酵香肠的感官和风味,缩短生产周期，同时又可抑制脂肪氧化、防止产品腐败变质,提升产品安全性。

利用本发明的模仿葡萄球菌与植物乳杆菌复配制备双菌种发酵剂，生产发酵香肠，香味浓郁，感官品质优于自然发酵香肠，并且生产周期短，同时能够有效抑制有害微生物生长繁殖，抑制脂肪氧化，可在一定程度上延长香肠的保质期，质量安全、稳定。利用本发酵剂生产发酵香肠可以大大降低汁液流失率，提高出品率，改善口感。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

sequencelisting

<110>河北经贸大学

<120>一株模仿葡萄球菌bp10及其在发酵香肠中的应用

<130>2018

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<170>patentinversion3.3

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