一种化合物及其水合物、盐或衍生物的用途的制作方法

本发明涉及制药领域，特别是一种化合物及其水合物或盐的用途。

背景技术：

缺血性脑卒中现在仍是危害人类性命的重大疾病之一,其发病率、致残率及死亡率都极高,由于该疾病的复杂性及神经修复的困难性,至今仍缺乏有效的治疗与预后手段。现有如抗炎、抗氧化等多种治疗方案被报道,但在临床治疗效果评价中,均未取得显著性突破。令人欣喜的是,干细胞用于心脑血管疾病治疗成为新的研究热点,也为脑缺血的治疗提供了新的方向。其中,骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmscs)是一种来源于骨髓基质系统中的非造血组织干细胞,具有较强的增殖能力且有多向分化潜能,在特定的理化环境或一些细胞因子的诱导下可以向神经系细胞(如神经元细胞、星形胶质细胞等)分化,且bmscs易获取、易在体外培养,具有较强的增殖能力,因此常被用于干细胞分化与治疗研究。目前最常用于诱导bmscs分化为神经样细胞的物质是β-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf),其中,bfgf来源少且价格昂贵,而β-巯基乙醇易引起细胞死亡且诱导成功后维持时间较短,因此需进一步研发新型药物分子用于干细胞治疗。

技术实现要素：

现如今并没有如式(i)结构式的化合物在作为诱导剂诱导干细胞分化为神经样细胞的相关报道，其中具有式(i)化合物的结构式如下：

更进一步的，是关于诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的相关报道。

通过研究发现，所述化合物在药学上可接受的水合物、盐或衍生物，在诱导干细胞分化为神经样细胞上同该结构式的化合物具有同等功效。

本发明所述诱导剂的作用即诱导细胞的分化。在本发明具体的实验过程中发现，采用式(i)化合物作为诱导剂具有明显的上调nse、gfap和nestin神经细胞蛋白表达量的作用。

其中，所述诱导干细胞分化为神经样细胞的方法，包括以下内容：取纯化的干细胞，然后置于含有诱导剂的培养液中培养12h以上，即得所述神经样细胞。所述干细胞为骨髓间充质干细胞。

申请经过实验发现，诱导剂的浓度超过10μm以后，细胞的存活率明显下降，而在2-10μm范围内时，细胞的存活率高于90％，因此，选定诱导剂的浓度为2-10μm。此处的诱导剂指的是上述式(i)化合物。

采用式(i)化合物主要是上调nse、gfap和nestin神经细胞蛋白表达量，其中蛋白gfap和nestin的表达量在诱导后24h达到峰值，蛋白nse的表达量在诱导后12h达到最高值，因此，诱导培养时间为12-24h。

本发明另一发明目的是提供一种如式(i)的化合物或其在药学上可接受的水合物、盐或衍生物作为诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞在制备预防或/和治疗缺血或缺血性损伤类疾病药物中的用途。

申请人利用广泛使用的小鼠大脑mcao缺血模型进行评价。其结果证实，经诱导后得到的神经样细胞对由小鼠大脑中动脉缺血再灌注引起的神经症状、脑梗塞范围扩大有效。

其中，所述药物为预防或/和治疗脑缺血或脑缺血性损伤类疾病的药物。

更进一步的，所述脑缺血类疾病或脑缺血性损伤类疾病为缺血脑卒中或脑缺血再灌注损伤。

申请人利用广泛使用的小鼠大脑mcao缺血模型进行评价，发现经诱导后得到的神经样细胞对由小鼠大脑中神经功能损伤有效。

本发明还提供了一种如式(i)的化合物或其在药学上可接受的水合物、盐或衍生物作为诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞在制备预防或/和治疗神经保护或修复类药物中的用途。

本发明还提供了一种如式(i)的化合物或其在药学上可接受的水合物、盐或衍生物作为诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的方法，包括以下内容：取纯化的干细胞，然后置于含有诱导剂的培养液中培养12h以上，即得所述神经样细胞。

其中，诱导剂的浓度为2-10μm。诱导培养时间为12-24h。

本发明有益效果：

一、本发明所述化合物及其在药学上可接受的水合物、盐或衍生物能诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞，诱导得到的神经样细胞不仅对神经保护具有显著的作用，同时对缺血脑卒中、脑缺血在灌注损伤类病症也具有明显的治疗的效果。

二、bmscs在体外分化为神经样细胞后，会有较好的脑靶向性，能更多地分布在脑病灶部位，发挥更加有效的治疗作用。

附图说明

图1是木香烃内酯对bmscs细胞毒性测定图；

图2是光学显微镜下观察bmscs形态学变化图，图中各区域分别为a.空白组，b.诱导4h，c.诱导12h，d.诱导24h；

图3是bmscs细胞骨架染色免疫荧光检测图，图中各区域分别为a.空白组，b.诱导4h，c.诱导12h，d.诱导24h；

图4是诱导后bmscs细胞nse，gfap及nestin免疫荧光染色图，图中各区域分别为a.空白组，b.诱导4h，c.诱导12h，d.诱导24h；

图5是术后动物脑组织ttc染色图；

图6是大鼠脑组织he染色图，图中各区域分别为a.假手术组，b.模型组，c.msc组，d.诱导组。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂及仪器

胎牛血清(gibco批号：1908121)；dmem低糖培养基(hyclone，批号：j180003)；胰蛋白酶(hyclone，批号：j180003)；四甲基偶氮唑盐(mtt)(锐赛生物公司，批号：180315)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(ttc)(源叶生物科技有限公司，批号：bcbr5460v)；4％多聚甲醛(biosharp，批号：180119)；96孔板(thermo，批号：167008)；苏木素染液套装(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：g1005)；nestin一抗(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：gb12137)；gfap一抗(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：gb11096)；nse一抗(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：gb11376-1)；二抗cy3山羊抗小鼠(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：gb21301)；二抗488山羊抗兔(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：gb25303)；二抗cy3山羊抗兔(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：gb21303)

1.1.2实验动物

spf级成年雄性sd大鼠40只，平均体重在280-300g，用于制备脑缺血再灌注动物模型；spf级2-4周龄雄性sd大鼠2只，平均体重在120-140g，用于制备骨髓间充质干细胞。

1.2试验方法

1.2.1bmscs的分离、培养

选取2-4周龄健康雄性sd大鼠脱颈处死，将全身浸入75％乙醇中消毒约10min。在无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪去两端骨骺，用5ml注射器抽取5ml含15％胎牛血清的dmem完全培养基先自一端冲出骨髓，再从另一端冲洗，制成单细胞悬液，置于10ml培养皿中，放置于37℃、体积分数为5％co2及饱和湿度培养箱中，24h后全量换液，以后每2d换液1次，去除非贴壁细胞，并按1：2比例传代。每日观察细胞的生长情况，待原代细胞融合达到80％-90％时，按1：2比例进行传代，并将培养基更换为含10％胎牛血清的dmem完全培养基。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。

1.2.2木香烃内酯对bmscs毒性检测

通过mtt检测木香烃内酯对bmscs的毒性。取第三代bmscs，按照每孔1.0×10⁴个细胞接种于96孔板中，放置于培养箱中24h使其贴壁。设置木香烃内酯的浓度梯度为2μm，5μm，10μm，20μm，40μm，60μm，80μm，并按分组加入相应浓度药物，置于培养箱中培养24h。培养结束后，每孔加入mtt(5mg·ml-1)20μl，避光培养2h后吸出培养基，每孔加入100μldmso，充分震荡后使用酶标仪检测吸光度，波长为570nm，记录结果，以药物浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制bmscs生存曲线。

1.2.3木香烃内酯诱导bmscs向神经样细胞分化

选择第3代bmscs，按照每孔1.0×10⁵个细胞接种于6孔板，放置于培养箱中培养24h使其贴壁。根据mtt结果，选择浓度为10μm的木香烃内酯溶液对bmscs进行诱导，根据时间设置4h，12h，24h共3组，定时观察细胞形态变化，并对其进行骨架染色。将诱导结束后的细胞固定，封片，通过免疫荧光染色的方法对其nse，gfap及nestin三种神经细胞标志蛋白的表达量变化进行检测。

1.2.4脑缺血再灌注动物模型制备

将40只大鼠随机平均分为假手术组(sham)，模型组(model)，msc组及木香烃内酯诱导msc组(诱导组)(n＝10)。使用改良zealonga’s线栓法制作大脑中动脉闭塞(mcao)局灶性脑缺血模型[12]。具体步骤为：以体积分数10％的水合氯醛溶液按0.33-0.36ml·100g^-1量进行腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于手术板，颈部常规消毒后备皮，于颈部正中切口，用棉签钝性分离肌肉，暴露出右侧颈总动脉，分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈总动脉近心端，于结扎出上端剪口，将线栓插入剪口处并进线(在线栓近头端1.5cm处标记，进线时标记点到达y型分支口即可)，缝合，消毒，每只大鼠术后补充5ml生理盐水，2h后拔出线栓进行再灌注。

根据longaz的5分制法进行神经功能损伤评分，选取1-2分的动物随机分组，在拔线后2h，每只由尾静脉注射含1.0×106个细胞的bmscs细胞或诱导后bmscs细胞悬液1ml(由pbs作溶剂)，假手术组与模型组注射等量pbs。术后2h，1d，3d，5d，7d对动物进行神经功能评分。于造模7d后，处死大鼠并取脑，对大脑行ttc染色及he染色，并采用干湿重法测量脑组织含水量。

1.2.5统计学分析

采用spss17.0对数据进行单因素方差分析，数据结果以均数±标准差表示，p<0.05表示有显著性差异，有统计学意义。

2.结果

2.1木香烃内酯对bmscs毒性检测

bmscs的存活率通过mtt实验检测，结果如图1所示，随木香烃内酯浓度增加，细胞在2-10μm浓度范围内存活率均高于90％，而浓度超过10μm时细胞存活率明显下降。说明木香烃内酯浓度在10μm以上时，具有较大的细胞毒性。因此，本实验中选择浓度为10μm的木香烃内酯对bmscs进行诱导。

2.2诱导后bmscs形态学研究，bmscs形态学变化用于评价木香烃内酯对bmscs向神经样细胞的诱导作用。光镜下观测结果如图2所示，在0-24h间，细胞由图a到图d，形态逐渐拉长并出现细胞分支，表现出神经细胞样形态。

通过细胞骨架(β-actin)染色对细胞形态进一步观察，结果如图3所示，细胞在木香烃内酯作用下，由图a中梭型、无分支样逐渐变化为图d中较长且有分支的形态，呈神经细胞样。骨架染色结果与光镜下观察结果一致。表明在木香烃内酯的条件诱导下，bmscs逐渐向神经样细胞分化。

2.3神经细胞标志蛋白免疫荧光染色

神经元特异性蛋白nse、nestin和星型胶质细胞特异性蛋白gfap是用来检测干细胞诱导分化后是否存在神经样细胞的指标。染色结果如图4，与空白组相比，木香烃内酯诱导bmscs后三种神经细胞标志蛋白的表达量均有升高，其中蛋白gfap和nestin的表达量在诱导后24h达到峰值，蛋白nse的表达量在诱导后12h达到最高值。证明bmscs在经木香烃内酯诱导后逐渐向神经样细胞分化。

2.4神经功能损伤评分

术后动物根据longaz的5分制法进行神经功能损伤评分，结果如表1所示，术后2h及1d内，msc组及诱导组(inducedmsc)动物的评分有所降低，但与模型组相比无显著性差异(p＞0.05)；术后5d、7d内，与模型组相比，msc组评分有明显下降(p＜0.05)，而诱导组评分与模型组相比差异更加明显(p＜0.01)。

表1术后动物神经功能损伤评分n＝10

注：*p＜0.05，**p＜0.01：与当天对应模型组神经功能损伤评分数据相比)

2.5ttc染色，脑梗死体积及脑组织含水量

术后7d，脑梗死情况如图5所示，msc组及诱导组大鼠脑梗死体积明显小于模型组，且诱导组大鼠脑梗死体积相较于msc组有明显减小。表2显示，诱导组大鼠脑部梗死体积为14.76％±0.56，与模型组相比明显下降，且有显著性差异(p<0.01)；msc组脑部梗死体积为23.15％±0.08，与模型组相比有所下降，但无显著性差异(p＞0.05)；诱导组大鼠脑部梗死体积与msc组相比也有显著下降(p<0.01)。模型组大鼠脑组织的含水量为81.19％±0.27，与假手术组相比明显增加，有显著性差异(p<0.05)；msc组脑组织含水量为80.80％±0.20，与模型组相比有所下降，但无显著性差异(p＞0.05)；诱导组大鼠脑组织的含水量为78.93％±0.38，与模型组相比明显下降，且有显著性差异(p<0.05)，与msc组相比也有显著性差异(p<0.05)，说明bmscs与诱导后bmscs均可使脑缺血损伤大鼠脑梗死体积减小并降低脑其含水量，且诱导组效果优于msc组。

表2术后动物脑梗死体积及脑组织含水量变化(n＝10)

注：*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组相比；&p＜0.05，与假手术组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与msc组相比

2.6he染色

图6中大鼠脑缺血半暗区组织学观察显示，假手术组神经元细胞结构正常，排列整齐紧密，染色均匀，细胞核大而圆；模型组神经元细胞结构损伤，可见神经元细胞核出现明显固缩和深染，细胞间质水肿，结构疏松；msc组与诱导组均可见大鼠缺血半暗带区固缩、浓染神经元减少，组织间隙水肿减轻，但两组相比，诱导组缺血半暗带区恢复效果优于msc组。以上实验结果说明，诱导后的bmscs对脑缺血再灌注损伤的治疗作用更加明显。

综上，胶质纤维酸性蛋白(gfap)是星形胶质细胞活化的标志物；神经元特异性烯醇化酶(nse)是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶；巢蛋白(nestin)是一种中间丝类型的蛋白，为神经干细胞的特征性标志物[23-24]。这三种蛋白是用于证明干细胞经诱导后向神经细胞分化的主要标志蛋白[14]。本研究中发现随木香烃内酯对bmscs诱导时间的延长，细胞形态逐渐拉长并出现分支，表现出神经样细胞形态，同时nse，gfap及nestin三种神经细胞标志蛋白的表达量也有所上调，证明木香烃内酯可诱导bmscs向神经样细胞分化。在此基础上，利用脑缺血再灌注大鼠模型对诱导后bmscs的治疗效果进行验证，由神经功能损伤评分、脑梗死体积、脑含水量及脑组织he染色结果可知，诱导组及msc组皆可减轻术后脑部损伤，通过对两组治疗结果进行对比，可见诱导组的治疗效果明显优于msc组。

bmscs经木香烃内酯诱导后可向神经样细胞分化，且用诱导后bmscs治疗脑缺血可显著降低病灶部位的损伤。干细胞治疗这一领域仍有无限潜能，今后可能会为治疗心脑血管疾病提供更好的方向与思路，具有很高的临床价值。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但上述实施例仅为本发明较佳的实施方式之一，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。