本发明涉及微生物制备
技术领域：
，具体涉及一种微生物菌群的制备方法。
背景技术：
：植物内生菌(endophyte)是在一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的一大类微生物，他们能与植物形成寄生、共生、腐生等关系。研究发现，不仅从各种植物中可以分离得到内生菌，而且在同一种植物的根、茎、叶、花、果实和种子等中均有内生菌被发现。内生菌数量庞大，种类众多，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。植物内生菌具有丰富的生物多样性，对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌或细菌通常为几种至几十种，有的甚至可达几百种。植物内生菌也是一种具有潜在应用价值的新的微生物资源，从植物内生菌中寻找新的生物活性物质成为研究的热点。技术实现要素：本发明第一目的在于，提供一种植物内生真菌(parengyodontiumsp.)md313901菌株。本发明第二目的在于，提供一种植物内生真菌(purpureocilliumsp.)md313902菌株。本发明第三目的在于，提供一种包含(parengyodontiumsp.)md313901菌株和(purpureocilliumsp.)md313902菌株的植物内生菌群。本发明第四目的在于，提供一种包含(parengyodontiumsp.)md313901菌株和/或(purpureocilliumsp.)md313902菌株的菌剂。本发明第五目的在于，提供本发明所述的植物内生真菌、植物内生菌群的分离方法。本发明第六目的在于，提供本发明所述的植物内生真菌、植物内生菌群的应用方法。一种植物内生真菌(parengyodontiumsp.)md313901菌株(本发明也简称为md313901)，其保藏号为cctccm2018256。本发明提供了一种全新的菌株，其属于内生真菌，命名为(parengyodontiumsp.)md313901，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地点为武汉，保藏时间为2018年5月8日；保藏号为cctccm2018256。此外，本发明还提供了另一全新的菌株，为植物内生真菌(purpureocilliumsp.)md313902菌株(本发明也简称为md313902)，其保藏号为cctccm2018257。本发明提供的全新的内生菌株md313902，属于内生真菌，命名为(purpureocilliumsp.)md313902，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地点为武汉，保藏时间为2018年5月8日；保藏号为cctccm2018257。本发明所述的md313901、md313902，具有相类似的功能，均能通过该菌株的发酵，可以显著促进天然药材的多糖成分或者是糖蛋白成分的提取，提升多糖提取率。本发明还提供了一种植物内生菌群，包含(parengyodontiumsp.)md313901菌株和(purpureocilliumsp.)md313902菌株。本发明创新地研究发现，本发明所述的(parengyodontiumsp.)md313901菌株和(purpureocilliumsp.)md313902菌株可以出人意料地提升天然药材发酵的多糖或糖蛋白提取率。此外，本发明人还研究发现，md313901菌株、md313902具有良好的协同性，可以进一步提升天然药材的多糖成分或者是糖蛋白成分的提取率。本发明还提供了一种植物内生菌菌剂，包括(parengyodontiumsp.)md313901菌株和/或(purpureocilliumsp.)md313902菌株，还包括其(菌株)耐于存活的辅料。本发明还提供了一种(parengyodontiumsp.)md313901菌株和/或(purpureocilliumsp.)md313902菌株的分离方法，包括植物组织预处理、浸出、分离、纯化：操作过程如下：(1)植物组织预处理植物组织经切段、乙醇溶液浸泡、次氯酸钠溶液浸泡后无菌水洗涤，得预处理植物组织；(2)植物组织内生菌浸出将预处理植物组织和生物酶研磨，分离出研磨液中的上清液；(3)植物内生菌株的分离、纯化将上清液涂布在培养基上，培养后挑选出所述的菌株或菌群。本发明研究发现，通过该方法，可以有效分离出目的菌株或者菌群。作为优选，本发明所述的植物组织为天然植物药材。所述的植物组织至少含有所述菌群中至少一种菌种。作为优选，所述的植物组织为玉竹、黄芪、沙棘、马齿苋、黄精、桔梗、山豆根、板蓝根、商陆、鱼腥草、延胡索、半夏、牛蒡根、桔梗、蒲公英、甘草、白芍、石斛、当归、石菖蒲中的至少一种。步骤(1)中，植物组织用水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度70-80％乙醇消毒1-2min，无菌水清洗，再用质量浓度3-8％次氯酸钠浸泡5-10min，后用无菌水冲洗，晾干表面水分，即为预处理植物组织。步骤(2)中，将预处理植物组织置于消毒过的研钵或研磨机中，加入生物酶进行研磨，研磨液转入锥形瓶中25-40℃条件下100-200rpm振荡1-2小时，分离得上清液和植物残渣。作为优选，生物酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶中的一种或多种。作为优选，生物酶用量为药材(植物组织)重量的0.01％-5％。步骤(3)中，在无菌条件下将浸出过程所得的上清液用无菌水稀释10-20倍，分别取100-200μl涂布于ms培养基上进行培养，培养一段时间形成菌落后，挑选不同形态的菌落，真菌至pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基培养，细菌至牛肉膏蛋白胨培养基培养。步骤(3)中，对分离得到的真菌采用划线法纯化。本发明所述的分离方法先通过消毒有效避免混入杂菌影响内生菌的分离效果，整个分离过程严格控制环境无菌，避免操作过程中带来外来杂菌。本发明所述植物内生菌群在不同产地、不同品种的同一药材中用同样制备方法提取均有分布。本发明还提供了一种(parengyodontiumsp.)md313901菌株和/或(purpureocilliumsp.)md313902菌株的应用，将其用于植物组织的发酵，用于提升植物组织多糖提取率。本发明研究发现，采用本发明md313901菌株和/或md313902菌株对天然植物进行发酵，可以显著提升天然植物的总多糖、糖蛋白的提取率。作为优选，所述的应用，将植物组织经酶解处理后再经所述(parengyodontiumsp.)md313901菌株和/或(purpureocilliumsp.)md313902菌株的发酵，用于提取植物组织多糖。本发明方法，可将植物组织中的多糖以外的某些成分进一步转化成多糖，从而，进一步提高发酵液中的多糖的含量，提高多糖的提取率。有益效果本发明提供了全新的(parengyodontiumsp.)md313901菌株和(purpureocilliumsp.)md313902菌株；并创新地发现该全新的菌株有助于提升天然药材总多糖、糖蛋白的提取率。此外，本发明还研究发现，(parengyodontiumsp.)md313901菌株和(purpureocilliumsp.)md313902菌株联合使用具有协同效果，有助于进一步提升天然药材的多糖的提取率。本发明分离方法筛选温度，重现性以及技术稳定性好。具体实施方式下面的实施例是对本发明的具体描述，这些实施例旨在对本发明进行进一步说明，不能理解为对发明的保护范围有任何限制，本领域的技术人员基于本申请作出的改进和调整也属于受保护的范围。实施例1植物内生菌群制备方法是经过以下步骤实现的：(1)植物组织预处理植物组织(采用表1所示的不同产地、不同品种玉竹植物药材)用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度70％乙醇消毒2min，无菌水清洗，再用质量浓度3％次氯酸钠浸泡10min，后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；(2)植物组织内生菌浸出将消毒后的玉竹组织置于消毒过的研钵中，加入生物酶(纤维素酶，用量为5％)进行研磨，研磨液转入锥形瓶中25℃条件下200rpm振荡2小时，得上清液和植物残渣。(3)植物内生菌株的分离、纯化在无菌条件下将浸出过程所得的上清液用无菌水稀释10倍，分别取200μl涂布于ms培养基上进行培养，培养一段时间形成菌落后，挑选不同形态的菌落，真菌至pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基培养，细菌至牛肉膏蛋白胨培养基培养。采用划线法纯化。选取不同产地、不同品种玉竹植物药材，分离其植物内生菌见表1。表1表1结果表明不同产地，不同品种的玉竹采用本专利分离方法同样能够得到两种菌种。本发明对本发明的md313901菌株的16srna片段进行分析，具有真菌特异性its2片段，且其和parengyodontiumsp.具有99％的同源性，命名为md313901，(parengyodontiumsp.)md313901菌株已经在2018年5月8日经中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为cctccm2018256。本发明对本发明的md313902菌株的16srna片段进行分析，具有真菌特异性its2片段，且其和purpureocilliumsp.具有99％的同源性，命名为md313902，(purpureocilliumsp.)md313902菌株已经在2018年5月8日经中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为cctccm2018257。实施例2植物内生菌群制备方法是经过以下步骤实现的：(1)植物组织预处理植物组织(取表2所示的不同产地、不同品种桔梗植物药材)用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度80％乙醇消毒1min，无菌水清洗，再用质量浓度8％次氯酸钠浸泡5min，后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；(2)植物组织内生菌浸出将消毒后的植物组织置于消毒过的研钵中，加入生物酶(果胶酶与纤维素酶1:1组成的混合酶，用量为2％)进行研磨，研磨液转入锥形瓶中40℃条件下100rpm振荡1小时，得上清液和植物残渣。(3)植物内生菌株的分离、纯化在无菌条件下将浸出过程所得的上清液用无菌水稀释20倍，分别取100μl涂布于ms培养基上进行培养，培养一段时间形成菌落后，挑选不同形态的菌落，真菌至pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基培养，细菌至牛肉膏蛋白胨培养基培养。采用划线法纯化。不同产地、不同品种桔梗植物药材采用本案例方法进行分离，采用划线培养的方法纯化，分离其植物内生菌，结果见表2。表2菌种安徽产桔梗云南产桔梗四川产桔梗黑龙江产桔梗md313901√√√√表2结果表明不同产地，不同品种的桔梗采用本专利分离方法同样能够得到一种菌种。实施例3植物内生菌群制备方法是经过以下步骤实现的：(1)植物组织预处理植物组织(取表2所示的不同品种商陆植物药材)用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度75％乙醇消毒1.5min，无菌水清洗，再用质量浓度5％次氯酸钠浸泡8min，后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；(2)植物组织内生菌浸出将消毒后的植物组织置于消毒过的研钵中，加入生物酶(果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶以1:1:1组成的混合酶，用量为0.1％)进行研磨，研磨液转入锥形瓶中35℃条件下200rpm振荡1.5小时，得上清液和植物残渣。(3)植物内生菌株的分离、纯化在无菌条件下将浸出过程所得的上清液用无菌水稀释20倍，分别取200μl涂布于ms培养基上进行培养，培养一段时间形成菌落后，挑选不同形态的菌落，真菌至pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基培养，细菌至牛肉膏蛋白胨培养基培养。采用划线法纯化。取不同品种商陆植物药材，采用划线培养的方法纯化，分离其植物内生菌，结果见表2。表3表3结果表明不同品种的商陆采用本专利分离方法同样能够得到两种菌种。应用例1：1.蒲公英药材的酶解破壁：取蒲公英药材10kg，除去杂质用自来水冲洗干净，倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入0.1％的果胶酶(总原料质量分数)和0.1％纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整ph值为6.8，控制温度48℃，酶解2个小时，后通入蒸汽灭菌40min。2.发酵冷却至室温后，加入0.3％(总原料质量分数)parengyodontiumsp.md313901菌株，在30℃环境下静置发酵6天，过滤，收集药液待处理。3.蒲公英多糖的提取及含量测定发酵后收集的药液加入药材8倍量的纯化水，100℃加热回流2次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得蒲公英总多糖。蒲公英多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后蒲公英多糖含量达到蒲公英干重的60.4％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出2.7倍。应用例2：1.牛蒡根药材的酶解破壁：取牛蒡根药材10kg，除去杂质用自来水冲洗干净，倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的果胶酶(总原料质量分数)和2％纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整ph值为6.8，控制温度50℃，酶解1.5个小时，后通入蒸汽灭菌30min。2.发酵：冷却至室温后，加入0.3％(总原料质量分数)purpureocilliumsp.md002菌株，在30℃环境下静置发酵5天，过滤，收集药液待处理。3.牛蒡根多糖的提取及含量测定发酵后收集的药液加入药材10倍量的纯化水，90℃加热回流2次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得牛蒡根多糖。牛蒡根多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后牛蒡根多糖含量达到牛蒡根干重的28.3％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出2.1倍。应用例3：1.组合物的酶解破壁称取石斛5kg、马齿苋5kg作为组合物，除去杂质用自来水冲洗干净，倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入3％的果胶酶(总原料质量分数)和2％纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整ph值为7.0，控制温度45℃，酶解3个小时，后通入蒸汽灭菌30min。2.发酵：冷却至室温后，加入1％(总原料质量分数)parengyodontiumsp.md313901菌株和1％(总原料质量分数)purpureocilliumsp.md313902菌株，在30℃环境下静置发酵10天，过滤，收集药液待处理。3.组合物多糖的提取及含量测定发酵后收集的药液加入药材10倍量的纯化水，65℃低温真空加热回流2次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得组合物多糖。组合物多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后组合物多糖含量达到组合物干重的30.2％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出2倍。应用例4：1.组合物的酶解破壁：取黄芪5kg、党参5kg药材，除去杂质用自来水冲洗干净，倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入4％的果胶酶(总原料质量分数)和1％纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整ph值为7.0，控制温度45℃，酶解3个小时，后通入蒸汽灭菌30min。2.发酵：冷却至室温后，加入2％(总原料质量分数)parengyodontiumsp.md313901菌株和2％(总原料质量分数)purpureocillium.sp.md313902菌株，在30℃环境下静置发酵10天，过滤，收集药液待处理。3.组合物多糖的提取及含量测定发酵后收集的组合物药液加入药材10倍量的纯化水，70℃低温真空加热回流2次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得组合物多糖。组合物多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后组合物多糖含量达到组合物药材干重的51.4％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出1.4倍。应用例5：1.组合物的酶解破壁：称取黄精5kg、山药5kg、商陆5kg、葛根5kg作为组合物，除去杂质用自来水冲洗干净，倒入发酵罐中，加入纯化水没过药材，加入1％的果胶酶(总原料质量分数)和4％纤维素酶(总原料质量分数)，充分搅拌混合，调整ph值为7.0，控制温度50℃，酶解4个小时，后通入蒸汽灭菌60min。2.发酵：冷却至室温后，加入3％(总原料质量分数)parengyodontiumsp.md313901菌株和3％(总原料质量分数)purpureocilliumsp.md313902菌株，在25℃环境下静置发酵15天，过滤，收集药液待处理。3.组合物多糖的提取及含量测定发酵后收集的组合物药液加入药材10倍量的纯化水，70℃低温真空加热回流2次，每次2小时，过滤，得提取液，浓缩到适当浓度，sevag法除去游离蛋白，后加入无水乙醇使溶液浓度达到80％，离心沉淀两次，沉淀物干燥得组合物多糖。组合物多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，测定结果显示，发酵后组合物多糖含量达到组合物干重的42.0％，与未进行本案例步骤2发酵步骤(进行步骤1的破壁处理后直接进行步骤3的提取)的案例比较发现，多糖含量高出2.1倍。当前第1页12