用于检测PIK3CD基因E1021K位点突变的探针和引物组合及试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合及试剂盒。
背景技术：
：pi3k-δ过度活化综合征是由pik3cd基因突变引起的一种常染色体显性遗传免疫缺陷病。该病通常表现为t细胞及b细胞分化和功能的缺陷。主要临床症状有：儿童期起病的反复呼吸道感染、淋巴结肿大、结节性淋巴样增生、脾大、进行性淋巴细胞减少、抗体应答缺陷以及cmv和/或ebv感染导致的病毒血症。虽然淋巴结病变和结节性淋巴样增生是非癌性的(良性的)，但pi3k-δ过度活化综合征也增加了形成癌症b细胞淋巴瘤的风险。该病起病早，病情重，严重者可致命。而该病可以通过雷帕霉素治疗，效果较好。因此早期诊断将有利于患儿的尽早治疗，挽救患者生命。目前针对pi3k-δ过度活化综合征可以通过对pik3cd全基因sanger测序或高通量测序技术(nextgenerationsequencing)对pik3cd基因及其它基因进行深度测序，可以获得pik3cd整个基因内的突变信息，但不可避免的存在测序成本高、实验周期长等缺点。前期研究发现c.3061g>a,p.e1021k为该病的突变热点，中华儿科杂志所报道的中国最大宗pi3k-δ过度活化综合征患者均为该点突变。因此如何实现快速的检测这个位点可以迅速的对该病进行初筛，缩短诊断周期、降低检测成本，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。技术实现要素：本发明针对上述的技术问题，提出一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合及试剂盒，以使pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的检测灵敏度更高、特异性更高且可重复性好，同时能够降低试验成本，实现pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的快速检测，并且能够区分野生型、杂合突变型及纯合突变型。如果该病存在体细胞突变或嵌合体，也可检测其突变频率。一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如seqidno:3所示。作为优选，所述正向引物、反向引物和所述突变型探针的摩尔比为1:1:1。作为优选，所述探针还包括野生型探针，所述野生型探针的核苷酸序列如seqidno:4所示。作为优选，所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。作为优选，所述荧光基团为fam、cy5、hex、vic、rox中的任一种。其中所述荧光基团和淬灭基团可基于实际的使用需要或成本考虑进行筛选。具体的所述突变型探针的荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1；所述野生型探针荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq2。或者所述所述突变型探针的荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq2；所述野生型探针荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1。上述所选择的两组荧光基团和淬灭基团，在实现pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变定量检测的基础上，具有较低的使用成本。作为优选，所述正向引物与反向引物的摩尔比为1:1，所述野生型探针与突变型探针的摩尔比为1:1，所述正向引物与所述野生型探针的摩尔比为(1-3)：1。更为优选的，所述正向引物、反向引物、野生型探针和突变型探针的摩尔比为1:1:1:1。一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的试剂盒，包括上述的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合。一种上述用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合在制备用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变及突变率的试剂盒中的应用。一种上述用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合在制备用于筛查pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变相关pi3kδ过度活化综合征的产品中的应用。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：本发明提供的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变探针和引物组合及试剂盒，通过设计科学合理的特异性的pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变检测引物、突变型探针和野生型探针，以更好的实现基于荧光定量pcr的方法以检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变，相对于sanger测序和高通量测序的检测方法，基于本发明提供的探针和引物的基础上所实现的荧光定量pcr的方法在保证高灵敏度和高特异性的基础上，实验周期更短、成本更低的效果。而特异性的荧光探针相对于普通的pcr，又降低了假阳性，即非特异性扩增的出现。针对提取的基因组dna，本发明可以进行最低50ngdna、突变率最低10％的检测，并且最终的荧光曲线ct值≤33，说明本发明所提供的引物和探针具有较高的灵敏度。附图说明后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：图1为本发明实施例1检测c.3061g>a,p.e1021k位点突变的野生型、e1021k杂合突变型、e1021k纯合突变型fam通道示意图；图2为本发明实施例1检测c.3061g>a,p.e1021k位点突变的野生型、e1021k杂合突变型、e1021k纯合突变型cy5通道示意图；图3为本发明实施例3检测c.3061g>a,p.e1021k位点不同突变频率fam通道示意图；图4为本发明实施例3检测c.3061g>a,p.e1021k位点不同突变频率cy5通道示意图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例提供了一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述探针包括突变型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如seqidno:3所示。在一可选实施例中，所述正向引物、反向引物和所述突变型探针的摩尔比为1:1:1。在一可选实施例中，所述探针还包括野生型探针，所述野生型探针的核苷酸序列如seqidno:4所示。在一可选实施例中，所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。在一可选实施例中，所述荧光基团为fam、cy5、hex、vic、rox中的任一种。其中所述荧光基团和淬灭基团可基于实际的使用需要或成本考虑进行筛选。具体的所述突变型探针的荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1；所述野生型探针的荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq2。或者所述所述突变型探针的荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq2；所述野生型探针的荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1。上述所选择的两组荧光基团和淬灭基团，在实现pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变定量检测的基础上，具有较低的使用成本。在一可选实施例中，所述正向引物与反向引物的摩尔比为1:1，所述野生型探针与突变型探针的摩尔比为1:1，所述正向引物与所述野生型探针的摩尔比为(1-3)：1。在一优选实施例中，所述正向引物、反向引物、野生型探针和突变型探针的摩尔比为1:1:1:1。针对本发明提供的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的突变型及野生型探针和引物组合，能够更好的实现基于荧光定量pcr的方法检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变。在进行pcr扩增时在加入本发明设计的一对引物的同时加入本发明设计的特异性的野生型及突变型荧光探针，探针两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。如果存在突变，则本发明提供的特异性的引物和探针会与目标dna模板结合，释放出荧光信号。这个荧光信号被荧光定量pcr仪检测到并转换为可读的荧光曲线，再结合荧光曲线进行分析，可知样本pik3cd基因的c.3061g>a,p.e1021k位点突变的情况。大大提高了pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变检测的灵敏度和特异性。本发明实施例还提供一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的试剂盒，包括上述的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合。对于本领域技术人员来说，针对上述提供的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合，结合本领域技术中的常规技术，能够直接获取得到制备用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的试剂盒的方法。本发明实施例还提供一种上述用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点的探针和引物组合在制备用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变及突变率的试剂盒中的应用。本发明实施例还提供一种上述用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合在制备用于筛查pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变相关的pi3k-δ过度活化综合征产品中的应用。对于本领域技术人员来说，针对上述提供的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合，结合本领域技术中的常规技术，能够直接获取得到制备用于筛查pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变相关的pi3k-δ过度活化综合征产品。为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合及试剂盒，下面将结合具体实施例进行描述。实施例1：一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述探针包括突变型探针和野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如seqidno:3所示；所述野生型探针的核苷酸序列如seqidno:4所示。所述突变型探针和野生型探针的5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团。所述突变型探针荧光基团为fam，淬灭基团为bhq1；所述野生型探针荧光基团为cy5,淬灭基团为bhq2。所述正向引物、反向引物、突变型探针和野生型探针的摩尔比为1:1:1:1。其中正向引物、反向引物和突变型荧光探针的组合可以用来检测pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k的突变；而正向引物、反向引物和野生型探针的组合可以用来检测pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k野生型的表达，而并非对c.3061g>a,p.e1021k位点突变进行检测。这是由于在设计突变型荧光探针时，将探针设计在c.3061g>a,p.e1021k位点突变上，只有发生突变才能进行正常的pcr反应，释放出一种荧光。而野生型探针设计基于没有c.3061g>a,p.e1021k位点突变的模板，只有样本为野生型时，pcr反应正常进行，释放出另一种荧光。可以通过对比突变型探针组和野生型探针组扩增的不同荧光曲线来获悉pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的量以及与未突变的模板的比例。因此该组合可区分野生型、杂合突变型、纯合突变型甚至嵌合体或发生体细胞突变时的突变比率。正常人野生型位点、pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k杂合突变型pi3k-δ过度活化综合征患者、pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k纯合突变型pi3k-δ过度活化综合征患者检测结果示意图分别如图1和图2所示。实施例2：一种用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的试剂盒，包括实施例1所述的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的探针和引物组合。所述试剂盒可直接选用市售购买的荧光定量试剂盒kapaprobefastqpcrkits(kapabiosystems，#kk4703)。也可自行制备所述试剂盒，例如所述试剂盒还可包括本领域试剂盒中所常规添加的组分，进一步还包括但不局限于如下的组分：引物缓冲液、探针缓冲液、pcr缓冲液、taq酶、dna聚合酶、mg2+、dntp等。本领域技术人员基于本发明实施例2提供的上述内容，及现有技术，能够直接获取到相应的试剂盒。实施例3：实施例2所提供的用于检测人类pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的试剂盒效果检测试验：使用外周血、毛发、颊粘膜所提的基因组dna，以及荧光定量试剂盒kapaprobefastqpcrkits(kapabiosystems，#kk4703)进行了实验，实验体系大小根据试剂盒推荐确定为20μl。在实验环境和其他条件均相同的情况下，对实验体系中的上述正向引物和反向引物浓度进行了优化测试，最终确定500nm的终浓度能够达到最好的检测效果。在实验环境和其他条件均相同的情况下，对实验体系中的荧光探针浓度进行了优化测试，最终确定500nm的终浓度能够达到最好的检测效果。最终确定的最佳反应体系如表1所示。实验反应条件在经过多次优化后，最终确定为：95℃5min；95℃15s，60℃1min，45个循环；40℃30s。表1最佳反应体系组成体积(μl)2×kapaprobemix10μldna模板50ng探针(10μm)1μl正向引物(10μm)1μl反向引物(10μm)1μl水补足至20μl总体积20μl设计合成含有pik3cd基因c.3061g>a,p.e1021k位点突变的质粒(突变频率100％)，以及完全野生型的pik3cd质粒(突变频率0％)。配置不同突变频率的阳性样本(0％、10％、20％、30％、50％)，进行检测下限实验。实验结果由图3和图4所示可知，本发明所述的试剂盒可以进行最低50ngdna、突变率最低10％的检测，并且最终的荧光曲线ct值≤33。表明本发明所提供的引物和探针组合及试剂盒具有很好的灵敏度。序列表<110>中国医学科学院北京协和医院<120>用于检测pik3cd基因e1021k位点突变的探针和引物组合及试剂盒<130>cc18k10282ccn<141>2018-12-24<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>artificialsequence<400>1gggaaaacagaggaggag18<210>2<211>18<212>dna<213>artificialsequence<400>2ccctttaggaccaatgtg18<210>3<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>3acggagggctttgttaaacttcac24<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>4acggagggcttcgttaaacttcac24当前第1页12