焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的方法与流程

本发明涉及一种焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。

背景技术：

牛尿苷酸合酶缺乏症（deficiencyofuridinemonophophatesynthase，dumps），是robinson等（1983）发现的，由于部分奶牛体内的尿苷酸合酶（uridinemonophophatesynthase，umps）缺乏造成乳中乳清酸的水平很高（超过300μg/ml，平均值为81.8μg/ml），并推测其遗传规律遵循常染色体隐性单基因遗传。根据红细胞中umps活性的高低，将荷斯坦牛群分为两种表型，其中正常表型牛的umps活性是缺陷表型牛的两倍，由于没有发现第三种表型，推测隐性纯合的基因型具有致死性。shanks等（1989）证实隐性基因纯合的胚胎，在母体妊娠40-60天死亡。

schober等（1992）克隆测序了牛的正常型umps基因cdna序列^[4]。通过将正常型umps基因的mrna与杂合子umps基因的序列进行比较，schwenger等（1993）发现杂合子umps基因的c-末端405处的密码子存在一个点突变(c→t的颠换)，原编码精氨酸的密码子cga转变为终止密码子的tga。

焦磷酸测序技术是近年发展起来的新技术，它是目前唯一得到定量序列结果的技术，具有极高的准确性，且重现性极佳，是一种通用型技术平台，功能多样，应用领域极广。具有高通量、低成本的特点，pcr产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小，符合出入境检验检疫的要求。鉴于dumps危害的严重性，加强dumps携带者的监测，提高检测方法的准确度和检测效率，对有效控制dumps的传播具有重要的意义。因此，本项目建立了焦磷酸测序方法检测dumps的方法，并在此基础上对在山东地区采集的奶牛样品进行检测。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一组焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的引物，序列如下：

上游引物：5’-aggcagcagtgcaaatgg-3’；

下游引物：5’-gtactgctggccgagattatca-3’；

测序引物：5’-ttggttttatttctggc-3’。

本发明还提供一种焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的方法，包括下列步骤：

(1)提取待检测奶牛的基因组dna。

(2)聚合酶链反应：步骤(1)中所得基因组dna为模板，权利要求1所示的核苷酸序列为引物，pcr扩增umps基因片段。

配制50μlpcr扩增体系，包含：10×pcrbuffer5.0μl，dntp5.0μl，上游扩增引物0.5μl，下游扩增引物0.5μl，rtaq0.5μl，水33.5μl，模板5.0μl；

循环程序为：94℃预变性5min后,进入94℃变性30s,退火,72℃延伸30s的循环,共循环50次；然后72℃再延伸10min,4℃结束；得扩增产物。

(3)焦磷酸测序单链样本制备。

使用50μl标记有生物素的pcr产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟。用vacuumpreptool将与磁珠结合后的pcr产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；denatureationbuffer洗5s；最后移到washingbuffer中清洗10s；vaccumpreptool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

(4)焦磷酸测序及结果分析。

反应在28℃下自动在pyromarkid仪器上检测，加样使用600mbar8-msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dntp的加入而延伸。随着核酸的结合，ccd摄像机检测到发出的光信号。

本发明还提供一种焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的试剂盒，包括下列组分：

上游引物、下游引物和测序引物，引物序列上述所示；扩增引物的pcr反应液，pcr反应液包括：10×pcrbuffer，dntp，rtaq。

本发明的有益效果是：

本发明建立的焦磷酸测序技术吸收了pcr和dna测序技术两方面的优势，在pcr特异性的基础上，应用很短的一段保守/特异序列的测定就可满足对分子诊断的需要，使得亚型鉴定结果更加可靠，方法更快捷。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1是扩增引物特异性试验电泳图。m.dnamarkerdl2000；1-2.牛基因扩增产物；

图2a/a纯化基因型焦磷酸测序结果。

图3a/a杂化基因型焦磷酸测序结果。

图4a/a杂化基因型焦磷酸测序结果。

具体实施方式

实施例1

一种焦磷酸测序技术检测荷斯坦奶牛尿苷酸合酶缺乏症的方法，包括下列步骤：

(1)提取待检测奶牛的基因组dna。

(2)聚合酶链反应：步骤(1)中所得基因组dna为模板，权利要求1所示的核苷酸序列为引物，，pcr扩增umps基因片段。

配制50μlpcr扩增体系，包含：10×pcrbuffer5.0μl，dntp5.0μl，上游扩增引物0.5μl，下游扩增引物0.5μl，rtaq0.5μl，水33.5μl，模板5.0μl；

循环程序为：94℃预变性5min后,进入94℃变性30s,退火,72℃延伸30s的循环,共循环50次；然后72℃再延伸10min,4℃结束；得扩增产物。

(3)焦磷酸测序单链样本制备。

使用50μl标记有生物素的pcr产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟。用vacuumpreptool将与磁珠结合后的pcr产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；denatureationbuffer洗5s；最后移到washingbuffer中清洗10s；vaccumpreptool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

(4)焦磷酸测序及结果分析。

反应在28℃下自动在pyromarkid仪器上检测，加样使用600mbar8-msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dntp的加入而延伸。随着核酸的结合，ccd摄像机检测到发出的光信号。对不同基因型的测序分析结果见如图2-4。

实施例2焦磷酸测序方法的引物特异性实验

提取构奶牛基因核酸，采用焦磷酸测序检测方法的pcr扩增引物进行扩增，结果显示特异性良好，扩增出与预期大小一致且单一的条带。如图1。

实施例3检测方法的重复性实验

对2份pcr-rflp检测为a/a和一份a/a的样品进行焦磷酸测序重复性检测，分别重复检测三次，读取的测序结果与实际测序结果进行核苷酸同源性比较。三次检测结果均与实际测序结果一致，该方法具有很好的重复性。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。