一种ABO血型突变检测位点的制作方法

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种新发现的可引发急性或迟发性溶血性输血反应abo血型a变异型的新突变位点。

背景技术：

abo血型系统主要是根据人类红细胞表面所含不同的凝集原，即血型抗原而命名的。根据凝集原a、b的分布把血液分为a、b、ab、o四型。目前采供血机构主要采用血清学方法对献血者血液标本进行正反定型,然而在大量的献血人群标本中常发现一些abo变异型(abo亚型)。例如本发明中发现的这例a变异型，红细胞上a抗原强度较正常红细胞减弱，血浆中存在抗-a1抗体，一旦输注a型人血液，极易发生输血性溶血反应。

溶血性输血反应(hemolytictransfusionreaction；htr)是受血者输入不相容红细胞或存在同种抗体的供者血浆，使供者红细胞或自身红细胞在体内发生破坏而引起的反应。溶血性输血反应按发生的缓急分为急性溶血性输血反应(ahtr)和迟发性溶血性输血反应(dhtr)。急性溶血性输血反应通常由abo血型系统不相容输血引起，在输血中或输血后数分钟至数小时内发生的血管内溶血，具有致死性危险，通常输入10～15ml血后即可发生。溶血性输血反应的发生，会影响患者的病情和输血疗效，严重时还可能导致患者死亡。因此，如何选择适当的血液输注，保证输血安全有效，至关重要。

溶血性输血反应主要由abo血型的错误输注引起，据美国fda报道，2009～2013年abo血型不合引起的溶血性输血反应占输血相关死亡率为7％。abo血型变异型(亚型)不合也会引起输血反应，部分a2亚型患者血清中有抗-a1抗体，2018年荷兰报道了一例a2亚型患者输入a1型红细胞引起严重的溶血性输血反应死亡的事件，因此应引起重视。在对a2亚型的筛查中，首次发现了一例新的a变异型，并针对此种新的a型变异型的新突变位点来建立快速检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种abo血型突变检测位点，即一种abo血型系统a型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的snp位点，从而弥补现有技术的不足。

申请人对一个a型变异型血型基因的患者进行了测序，找到了该患者a型变异型基因存在遗传上的致病突变，造成了a抗原数量和功能的改变，并且通过免疫刺激产生抗-a1抗体，一旦发生错误血型的输注(输注a型血)，很有可能发生致命的危害。为了避免其通过输血造成急性溶血性输血反应，从而促成了本项发明。

本发明提供一种用于检测abo血型系统a型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的新突变位点，为abo血型基因编码区域由起始密码子起第467和798位碱基；其中第467位碱基发生了ct杂合突变，第798位碱基插入t碱基发生了移码突变。

其中用于检测上述新突变位点的直接扩增及测序引物信息如下：

abo-e7f:5'-gtggacgtggacatggagt-3'seqidno:1

abo-e7r:5'-gcagtgaacctcagcttcctca-3'seqidno:2

用于检测上述新突变位点单倍型扩增及测序引物信息如下：

abo-e6mo：5'-cgggatccatgtgggtggcaccctgcca-3'seqidno:3

abo-e7mo：5'-gggcctaggcttcagttactc-3'seqidno:4

本发明提供了一种新发现的可引发急性或迟发性溶血性输血反应abo血型a变异型的新突变位点，并建立快速检测方法，从而提供了一种有效的避免急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的新突变位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行abo血型a型变异型基因突变位点的快速检测。

附图说明

图1：abo血型a型变异型基因先证者基因突变位点测序图，正常a型参考序列，参比序列来源于bgmut(国际血型基因突变库)；

图2：先证者直接测序图；

图3：先证者克隆测序图，先证者abo基因编码区域由起始密码子起第467位、第798位碱基发生了突变(nt467c＞t；nt798inst)。

具体实施方式

申请人在常规abo血型鉴定时，发现一例正反定型不符的患者，通过基因检测发现致病性snp位点，并证实该突变导致患者红细胞上的a抗原比正常人a抗原表达弱，并且血浆中产生同种抗-a1抗体。一旦输入a型血液，很可能引发急性溶血性输血反应，为了做到及时检测和预防，从而促成了本发明。

a变异型位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成大约1065bp的mrna(ncbi登录号为nm_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：对abo血型基因a型变异型先证者基因检测，确认a型变异型的突变位点。

1、提取外周血基因组dna：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取abo血型a型变异型基因家系成员外周静脉血5ml，放入edta-na2抗凝管内；dna提取使用invirtrogen公司的dna提取试剂盒，具体操作流程如下：

吸取标本的抗凝全血300～500μl，采用基因组dna提取试剂盒提取其基因组dna，并且调整基因组dna含量为30～50ng/μl，纯度为1.8～2.0。

对提取的dna行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测dna纯度及浓度。

2、直接测序法检测先证者a变异型基因的突变位点

(1)pcr反应体系：

应用该反应体系进行先证者的基因组dna模板与上述abo-e7f、abo-e7r引物的扩增反应。

(2)pcr反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。

pcr产物测序：应用常规sanger测序法对上述pcr产物进行测序，其中应用引物对abo-e7f:5'-atccgcctgccttgcagata-3'；abo-e7r:5'-agcctaggcttcagttactcacaaca-3'在先证者发现abo血型a基因编码区域由起始密码子起第467位、第798位碱基发生了突变。其中第467位碱基出现ct杂合序列；第798位碱基开始出现双峰。多次测序结果表明该突变位点的确存在该突变，并不是因为扩增或测序错误引进的(图2)。

3、对abo基因第6,7外显子及第6内含子进行单倍型测序，确定先证者a变异型基因的突变位点

pcr扩增目的片段引物：abo-e6mo：5'-cgggatccatgtgggtggcaccctgcca-3'；abo-e7mo：5'-gggcctaggcttcagttactc-3'。

pcr扩增引物也可以选用其它能扩增上述snp位点的引物对。

pcr扩增目的片段的反应条件与反应体系：

(1)pcr反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组dna模板与发明者设计的克隆测序的引物进行扩增反应。将pcr产物克隆入t载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用abo-e6mo：5'-cgggatccatgtgggtggcaccctgcca-3'；abo-e7mo：5'-gggcctaggcttcagttactc-3'(测序引物也可以选用从a型变异基因上设计的，能扩增snp位点的其它引物)确定样本的单倍型序列(图3)。该突变为一新发现的突变。该突变不存在于下面的两个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，血型基因突变库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi？cmd＝bgmut/systems_info&system＝abo)，表明该突变非常罕见，该突变导致了编码a血型的蛋白组成的核苷酸发生改变，a基因编码区域由起始密码子起第467位由c＞t,导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸；第798位碱基由于拆入t，导致了移码突变；氨基酸的突变从而引起了此a变异型的个体a抗原表位发生缺失抗原减弱，导致这种个体不需要免疫刺激就能够产生血浆中能够产生同种的抗-a1抗体(天然免疫)，当输注正常人的a型血液时就会发生急性溶血性输血反应，从而危及患者生命。而在近430余例正常当地人群的外周血基因组dna样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组dna，应用上述dna作为模板与abo-e7f、abo-e7r引物进行pcr目的片段的扩增，常规sanger测序法应用上述这对引物对pcr产物进行直接测序，发现该先证者的两名家系成员的abo血型a基因存在本发明中发现的snp突变，即编码区域由起始密码子起第467位碱基发生了ct杂合突变，第798位碱基插入t碱基发生了移码突变。继续对发现突变的两位家系成员进行abo基因第6,7外显子及第6内含子的单倍型测序，应用上述提取的一名家系成员(先证者父亲)的基因组dna作为模板与abo-e6mo、abo-e7mo引物进行pcr目的片段的扩增，将pcr产物克隆入t载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现，两位家系成员a基因编码区域由起始密码子起第467位由c＞t,导致了第156位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸；第798位碱基插入t碱基，与先证者完全一致，而且这一名家系个体血浆中都存在同种抗-a1抗体。

通过上述的分析，证明发明者设计的引物可以用来检测个体abo血型基因是否发生a基因突变，从而有潜在的发生输血后急性输血型溶血反应的危险。

序列表

<110>青岛市中心血站

<120>一种abo血型突变检测位点

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtggacgtggacatggagt19

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcagtgaacctcagcttcctca22

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgggatccatgtgggtggcaccctgcca28

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gggcctaggcttcagttactc21