OCT4抗原表位肽、抗原偶联物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及免疫生物学领域，特别是涉及一种oct4抗原表位肽、抗原偶联物及其制备方法和应用。

背景技术：

肿瘤疫苗(tumorvaccine)是近年研究的热点之一，其原理将肿瘤抗原以多种形式如：肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等，导入患者体内，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。

日新月异的肿瘤免疫治疗已迅速改变肿瘤患者的预期寿命，引发肿瘤治疗的新变革。然而。近几十年来的研究表明，肿瘤疫苗成功研发并应用的屈指可数，其重要原因在于，这些疫苗对肿瘤细胞的抑制作用较差。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种对肿瘤细胞具有较好抑制作用的oct4抗原表位肽。

此外，还提供一种oct4抗原表位肽的制备方法和应用、抗原偶联物及其制备方法和应用。

一种oct4抗原表位肽，所述oct4抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.1所示；

或者，所述oct4抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.2所示。

研究发现，氨基酸序列如seqidno.1所示或如seqidno.2所示的oct4抗原表位肽能够有效地抑制睾丸癌细胞的生长，以延长睾丸癌患者的寿命，从而能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。经试验验证，注射有上述oct抗原表位肽偶联血蓝蛋白的抗原偶联物的小鼠内的睾丸癌细胞的体积和重量明显低于仅注射血蓝蛋白的小鼠内的睾丸癌细胞的体积和重量，且注射有上述oct抗原表位肽偶联血蓝蛋白的抗原偶联物的小鼠内的寿命明显长于仅注射血蓝蛋白的小鼠的寿命。

一种oct4抗原表位肽的制备方法，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或转基因方法制备得到oct4抗原表位肽，所述oct4抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.1所示；或者，所述oct4抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.2所示。

一种抗原偶联物，所述抗原偶联物包括抗原部分，所述抗原部分含有上述oct4抗原表位肽；

或者，所述抗原部分含有上述oct4抗原表位肽的制备方法制备得到的oct4抗原表位肽。

在其中一个实施例中，所述抗原偶联物还包括偶联部分，所述偶联部分与所述抗原部分连接，所述偶联部分选自血蓝蛋白、卵清蛋白及牛血清白蛋白中的至少一种。

一种抗原偶联物的制备方法，包括如下步骤：

将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、n-羟基琥珀酰亚胺、抗原部分与偶联部分混合并反应，以使所述抗原部分与所述偶联部分连接，得到抗原偶联物；其中，所述抗原部分含有上述oct4抗原表位肽，或者，所述抗原部分含有上述oct4抗原表位肽的制备方法制备得到的oct4抗原表位肽。

上述oct4抗原表位肽在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用；

或者，上述oct4抗原表位肽制备方法得到的oct4抗原表位肽在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用；

或者，上述抗原偶联物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用；

或者，上述抗原偶联物的制备方法得到的抗原偶联物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。

上述oct4抗原表位肽在制备延长肿瘤患者寿命的药物中的应用；

或者，上述oct4抗原表位肽制备方法得到的oct4抗原表位肽在制备延长肿瘤患者寿命的药物中的应用；

或者，上述抗原偶联物在制备延长肿瘤患者寿命的药物中的应用；

或者，上述抗原偶联物的制备方法得到的抗原偶联物在制备延长肿瘤患者寿命的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述肿瘤为睾丸肿瘤。

一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有上述oct4抗原表位肽；

或者，所述药物组合物含有上述oct4抗原表位肽的制备方法制备得到的oct4抗原表位肽；

或者，所述药物组合物包括上述抗原偶联物；

或者，所述药物组合物包括上述抗原偶联物的制备方法得到的抗原偶联物。

在其中一个实施例中，所述药物组合物还包括toll样受体激动剂。

附图说明

图1为实施例3中klh组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤体积的对比图；

图2为实施例3中klh组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤重量的对比图；

图3为实施例3中klh组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤的照片对比图；

图4为实施例4中pbs组、tlr9组、oct4-3组、oct4-3+tlr9组小鼠的肿瘤体积的对比图；

图5为实施例5中pbs组、klh组、tlr9组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组的小鼠存活率对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种oct4抗原表位肽，其能够有效地抑制睾丸癌细胞的生长，以延长睾丸癌患者的寿命，从而能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。进一步地，肿瘤为睾丸肿瘤。具体地，肿瘤为睾丸畸胎瘤。

oct4基因也被称为oct3、pou5f1、oct3或oct4，是pou转录因子家族中的一员。人的oct4基因位于6号染色体上(6p21.31)，长度为16.40kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mrna亚型，从而翻译成多种蛋白质。研究发现，转录因子oct4(octamer-bindingtranscriptionfactor4)在多种肿瘤干细胞的形成和保持肿瘤干细胞特性和功能方面起到重要作用，在肿瘤干细胞中高表达而在正常人体已分化细胞中不表达，是良好潜在的生物治疗靶点。

在其中一个实施例中，oct4抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。具体地，如seqidno.1所示的氨基酸序列为：enrvrgnlenlflqcpkptlqqishiaqqlgle。

在其中一个实施例中，oct4抗原表位肽的氨基酸序列如seqidno.2所示。具体地，如seqidno.2所示的氨基酸序列为：eaagspfsggpvsfplapgphfgtpgygsphf。

研究发现，氨基酸序列如seqidno.1所示或如seqidno.2所示的oct4抗原表位肽能够有效地抑制睾丸癌细胞的生长，以延长睾丸癌患者的寿命，从而能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。经试验验证，注射有上述oct抗原表位肽偶联血蓝蛋白的抗原偶联物的小鼠内的睾丸癌细胞的体积和重量明显低于仅注射血蓝蛋白的小鼠内的睾丸癌细胞的体积和重量，且注射有上述oct抗原表位肽偶联血蓝蛋白的抗原偶联物的小鼠内的寿命明显长于仅注射血蓝蛋白的小鼠的寿命。

上述oct4抗原表位肽的制备方法，包括如下步骤：通过多肽固相合成法或转基因方法制备得到oct4抗原表位肽。

在其中一个实施例中，多肽固相合成法为boc固相合成法或fmoc固相合成法。其中，boc为叔丁氧羰基。boc固相合成法中以易酸解的boc基团作为n-ɑ-保护基团。fmoc为9-芴甲氧羰基。fmoc固相合成法中以易酸解的fmoc基团作为n-ɑ-保护基团。

在其中一个实施中，转基因方法具体为：构建重组载体，重组载体含有上述oct4抗原表位肽的编码序列。通过构建重组载体能够较好地保存编码上述oct4抗原表位肽的编码序列，有利于oct4抗原表位肽的表达。

进一步地，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。重组载体能够表达或克隆oct4抗原表位肽。

更进一步地，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于oct4抗原表位肽的分离纯化。进一步地，纯化标签为his标签、gst标签或sumo标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。

具体地，重组载体包括基因工程载体。编码上述oct4抗原表位肽的核苷酸插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pet-32a载体、pgex-6p-1载体、ppic-9k载体或ppic-zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。

在其中一个实施中，转基因方法具体为：通过构建重组细胞，重组细胞含有上述oct4抗原表位肽的核苷酸或上述重组载体。重组细胞为克隆编码上述oct4抗原表位肽的核苷酸的细胞或表达编码上述oct4抗原表位肽的核苷酸的细胞。

通过构建重组细胞，能够克隆或表达上述oct4抗原表位肽，使得能够大规模的制备oct4抗原表位肽，并且通过重组细胞定向表达该oct4抗原表位肽，以能够获得纯度较高的oct4抗原表位肽，进而有利于oct4抗原表位肽的应用。

进一步地，重组细胞包括受体细胞。编码上述oct4抗原表位肽的核苷酸或上述重组载体位于受体细胞内。

更进一步地，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细胞。具体地，受体细胞为大肠杆菌dh5α、大肠杆菌top10、大肠杆菌orgami(de3)、毕赤酵母gs115或毕赤酵母smd1168。需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。

上述oct4抗原表位肽的制备方法，工艺简单、操作方便，且能够制备纯度较高的oct4抗原表位肽，以能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。

一实施方式的抗原偶联物包括抗原部分，抗原部分含有上述oct4抗原表位肽。通过将上述oct4抗原表位肽制成抗原偶联物，有利于刺激辅助性t细胞而诱导b细胞产生较强免疫反应，以有效地抑制肿瘤细胞的生长，以延长肿瘤患者的寿命，从而能够应用于制备抑制肿瘤细胞生长的药物或延长肿瘤患者的药物中。进一步地，肿瘤为睾丸肿瘤。

进一步地，抗原偶联物还包括偶联部分。偶联部分与抗原部分连接。更进一步地，偶联部分选自血蓝蛋白(klh)、卵清蛋白(ova)及牛血清白蛋白(bsa)中的至少一种。该偶联部分能够与抗原部分偶联，以激起更加充分的免疫反应。

可选地，偶联部分为klh。klh(keyholelimpethemocyanin)，即血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一能够与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量45000～130000。klh比bsa有更高的免疫原性。

在一个具体示例中，抗原部分为上述oct4抗原表位肽，偶联部分为klh。

经试验验证，注射有上述oct抗原表位肽偶联血蓝蛋白的抗原偶联物的小鼠内的睾丸癌细胞的体积和重量明显低于仅注射血蓝蛋白的小鼠内的睾丸癌细胞的体积和重量，且注射有上述oct抗原表位肽偶联血蓝蛋白的抗原偶联物的小鼠内的寿命明显长于仅注射血蓝蛋白的小鼠的寿命，以能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。

一实施方式的抗原偶联物的制备方法，包括如下步骤：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、n-羟基琥珀酰亚胺、抗原部分与偶联部分混合并反应，以使抗原部分与偶联部分连接，得到抗原偶联物；抗原部分含有上述oct4抗原表位肽或上述oct4抗原表位肽的制备方法制备得到的oct4抗原表位肽。

具体地，将edc(即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、nhs(即n-羟基琥珀酰亚胺)、oct4抗原表位肽与klh混合，并于4℃下振荡过夜反应，得到混合液；将混合液固液分离并收集沉淀，得到抗原偶联物。

在其中一个实施例中，在将edc、nhs、oct4抗原表位肽与klh混合之前，还包括如下步骤：将oct抗原表位肽溶于pbs缓冲液中，得到预混液。其中，预混液中oct抗原表位肽的浓度为0.8mg/ml～1.2mg/ml。pbs缓冲液为ph为7.2～7.4的pbs缓冲液。进一步地，预混液中oct抗原表位肽的浓度为1mg/ml。

在其中一个实施例中，edc、nhs、oct4抗原表位肽与klh的的摩尔比为100:100:10:1。

在其中一个实施例中，将混合液固液分离并收集沉淀，得到抗原偶联物的步骤中，固液分离的方式为超滤离心。进一步地，采用10kd超滤管进行超滤离心。

在其中一个实施例中，将混合液固液分离并收集沉淀的步骤之后，还包括采用清洗沉淀。具体地，采用pbs缓冲液倍比梯度洗涤沉淀，以去除沉淀中的无机盐和催化剂。进一步地，洗涤次数为至少3次。

上述抗原偶联物的制备方法操作简单，能够制备具有较高纯度的抗原偶联物，以能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。

一实施方式的药物组合物含有上述oct4抗原表位肽或者上述oct4抗原表位肽的制备方法制备得到的oct4抗原表位肽。上述oct4抗原表位肽具有抑制肿瘤细胞生长和延长肿瘤患者寿命的效果，使得上述药物组合物能够抑制肿瘤细胞生长和延长肿瘤患者寿命。

在其中一个实施例中，肿瘤为睾丸肿瘤。具体地，肿瘤为睾丸畸胎瘤。

在其中一个实施例中，上述药物组合物包括上述抗原偶联物或上述抗原偶联物的制备方法得到的抗原偶联物。上述oct4抗原表位肽以抗原偶联物的形式存在于药物组合物中，能够更加有效地抑制肿瘤细胞的生长，延长肿瘤患者的寿命。

进一步地，药物组合物还包括toll样受体激动剂。toll样受体(toll-likereceptors，tlr)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。tlr是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，tlr能够识别微生物并激活机体产生免疫细胞应答。

具体地，toll样受体激动剂为toll样受体9激动剂。toll样受体9(即tlr9)为tlr的一种亚科，能够识别细菌的cpg-dna，激活b细胞和apc的免疫刺激特性。需要说明的是，toll样受体激动剂不限于为toll样受体9激动剂，可以为其他的toll样受体激动剂，例如可以为toll样受体7激动剂。

在其中一个实施例中，药物组合物中，抗原偶联物与toll样受体激动剂的体积比为1：1。此设置，有利于药物组合物发挥抑制肿瘤细胞生长的功效，以延长肿瘤患者的寿命。

在其中一个实施例中，药物组合物还包括药物学上可接受的辅料。进一步地，药物学上可接受的辅料包括溶剂、稀释剂及赋形剂中的至少一种。

溶剂用于溶解或悬浮抗原偶联物。溶剂为无菌水或生理盐水。

稀释剂用于稀释抗原偶联物。稀释剂包括淀粉、糖、纤维素及无机盐中的至少一种。具体地，淀粉例如可以为支链淀粉。糖例如可以为甘蔗多糖。纤维素例如可以为甘蔗纤维素。无机盐例如可以为氯化钠盐。

赋形剂用于使药物组合物呈现特定的形态。具体地，赋形剂使药物组合物呈液体制剂或粉剂等形态。

在其中一个实施例中，药物组合物中，抗原偶联物与药物学上可接受的辅料的质量比为0.8:1～1.2:1。进一步地，药物组合物中，抗原偶联物与药物学上可接受的辅料的质量比为1：1。

上述药物组合物含有上述oct4抗原表位肽或者上述oct4抗原表位肽的制备方法制备得到的oct4抗原表位肽，具有抑制肿瘤细胞生长和延长肿瘤患者寿命的功效。

再者，上述药物组合物中，oct4抗原表位肽以抗原偶联物的形式存在，且药物组合物中还包括toll样受体激动剂，抗原偶联物与toll样受体激动剂协同作用，能够显著地抑制肿瘤细胞的生长，以进一步地延长肿瘤患者的寿命。

以下为具体实施例部分：

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[m](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

如未特别说明，以下实施例中，tlr9(即toll样受体9激动剂)购于北京博奥龙免疫技术有限公司。dmem培养基购于hyclone公司。fbs(胎牛血清，fetalbovineserum)购于hyclone公司。klh(即血蓝蛋白)购于sigma公司。ph为7.3的pbs缓冲液购于北京索莱宝科技有限公司。

实施例1

oct4抗原表位肽的合成

1、根据设计的氨基酸序列，采用化学合成方法合成oct4抗原表位肽。其中，氨基酸序列如seqidno.1所示的oct4抗原表位肽命名为oct4-2。氨基酸序列如seqidno.2所示的oct4抗原表位肽命名为oct4-3。设计并合成氨基酸序列如seqidno.3所示的oct4抗原表位肽，作为对照，并命名为oct4-1；如seqidno.3所示的氨基酸序列具体为：dnnenlqeickaetlvqarkrkrtsie。三种oct4抗原表位肽的合成由上海强耀生物科技有限公司合成。

2、合成的具体过程为：

(1)合成的顺序为从c端到n端。称取n当量的树脂放入反应器，加入dcm(二氯甲烷)溶胀半小时；然后抽掉dcm，加入序列中2n当量的c末端的第一个氨基酸，加2n当量的diea(n,n-二异丙基乙胺)，再加入dmf(二甲基甲酰胺)和dcm通入氮气鼓泡反应60min；其中，再加入dmf和dcm的量能够使树脂充分被鼓动。反应结束后，加入5n当量的甲醇反应，反应半小时后抽掉反应液，得到第一反应物，用dmf、甲醇冲洗第一反应物。接着，往装有第一反应物的反应器中加入2n当量的第二个氨基酸，2n当量的hbtu(1-羟基苯并三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及diea，通入氮气鼓泡反应半小时，抽掉反应液，得到第二反应物，并用dmf、甲醇冲洗第二反应物；采用茚三酮检测第二反应物。按照同样的操作将组成oct4抗原表位肽的各个氨基酸依次连接。

(2)n末端的氨基酸连接后，用吡啶和乙酸酐封端，清洗封端后的反应物；再向封端后的反应物中加入脱帽液，以去除fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，清洗脱帽后的反应物，再用茚三酮检测。将脱帽后的反应物用氮气吹干后从反应器中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加入的切割液反应，切割液和脱帽后的反应物的比例为每克脱帽后的反应物加入10ml切割液，切割液以质量百分含量计包括95％的tfa(三氟乙酸)、2％的乙二硫醇、2％的三异丙基硅烷及1％的水，震荡，固液分离，收集滤液。然后向滤液中加入乙醚以析出沉淀，固液分离后收集并清洗沉淀，得到粗产物。用高效液相色谱对粗产物提纯至要求纯度。将纯化收集的液体浓缩干燥成粉，即为oct4抗原表位肽。三种oct4抗原表位肽均为白色粉末。

实施例2

抗原偶联物(即oct4偶联klh载体蛋白)的制备

(1)采用ph为7.3的pbs缓冲液溶解oct4抗原表位肽，得到浓度为1mg/ml的预混液。

(2)将edc、nhs、oct4抗原表位肽与klh混合，并于4℃下振荡过夜反应，得到混合液；edc：nhs：oct4：klh的摩尔比为100：100：10：1。将混合物至于10kd超滤管中离心，再用pbs倍比梯度洗涤，以去除无机盐和催化剂，洗涤三次，收集沉淀，并对沉淀进行定量检测，得到抗原偶联物。

需要说明的是，上述三种oct4抗原表位肽均用上述方法制备得到三种抗原偶联物，分别命名为oct4-1-klh、oct4-2-klh、oct4-3-klh。

实施例3

oct4抗原表位肽对肿瘤细胞的影响

1、实验分组：

实验共分为四组，每组四只小鼠。四组分别为klh组、oct4-1组、oct4-2组、oct4-3组。小鼠为雄性balb/c小鼠(4周龄～6周龄)，并根据深圳实验动物单位发布的指南在无菌条件下饲养。

2、免疫后小鼠的制备：

(1)初次免疫(即d0)：klh组的小鼠注射klh，每只注射100μl。oct4-1组的小鼠注射oct4-1-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。oct4-2组的小鼠注射oct4-2-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。oct4-3组的小鼠注射oct4-3-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。各组小鼠注射后均在无菌条件下饲养。给药途径为腹腔注射。

(2)二次免疫(即d14)：在初次免疫之后，于第14天按照上述操作对各组初次免疫的小鼠进行二次免疫。

(3)三次免疫(即d21)：在初次免疫之后，于第21天按照上述操作对各组二次免疫的小鼠进行三次免疫。

(4)加强免疫(即d28)：在初次免疫之后，于第28天按照上述操作对各组三次免疫的小鼠进行加强免疫，得到免疫后的小鼠。

3、oct4抗原表位肽对肿瘤细胞的影响

(1)小鼠睾丸畸胎瘤f9细胞(即f9细胞)在37℃、5％co2环境中培养。培养基为：向dmem培养基中添加体积百分含量为10％的热灭活的fbs(胎牛血清)、100u/ml的青霉素(购于invitrogen，carlsbad，ca)和100μg/ml的链霉素(购于invitrogen，carlsbad，ca)，得到培养基。

(2)用胰蛋白酶(购于hyclone公司)消化处于指数生长期的小鼠睾丸畸胎瘤f9细胞，用4℃的ph为7.3的pbs缓冲液洗涤两次。用4℃的ph为7.3的pbs缓冲液将洗涤后的细胞重悬，得到重悬液，重悬液中细胞浓度为2×10⁶个/ml。

(3)给上述各组的免疫后小鼠注射重悬液，注射量为2×10⁶个f9细胞/只。各组小鼠注射后均在无菌条件下饲养；饲养10天(即注射重悬液后饲养10天)后，每隔两天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和宽径(b)。通过如下公式v＝1/2×a×b²计算肿瘤体积(v)。同时，接种肿瘤后17天后，处死小鼠，剥离小鼠的肿瘤，并对肿瘤进行称重和拍照。测定结果详见图1～3。图1为实施例3中klh组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤体积的对比图。图2为实施例3中klh组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤重量的对比图。图3为实施例3中klh组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤的照片对比图。

从图1可以看出，oct4-1组小鼠的肿瘤体积随培养时间的变化速率与klh组大致相同，且培养至17天时，oct4-1组与klh组小鼠的肿瘤体积大致相同，说明oct4-1抗原表位肽对肿瘤的生长没有抑制作用。oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤体积随培养时间的变化速率明显低于klh组，且培养至17天时，oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤体积明显低于klh组，说明oct4-2抗原表位肽与oct4-3抗原表位肽均能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，尤其是oct4-3抗原表位肽的抑制作用更加明显。

从图2可以看出，oct4-1组小鼠的肿瘤重量明显高于klh组，进一步证明oct4-1抗原表位肽对肿瘤的生长没有抑制作用。oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤重量明显低于klh组，进一步证明oct4-2抗原表位肽与oct4-3抗原表位肽均能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，尤其是oct4-3抗原表位肽的抑制作用最为明显。

从图3可以看出，oct4-1组小鼠的肿瘤体积明显大于klh组，从表观上证明oct4-1抗原表位肽对肿瘤的生长没有抑制作用。oct4-2组及oct4-3组小鼠的肿瘤体积明显小于klh组，从表观上证明oct4-2抗原表位肽与oct4-3抗原表位肽均能够有效地抑制肿瘤细胞的生长，尤其是oct4-3抗原表位肽的抑制作用最为明显。

实施例4

oct4-3-klh对肿瘤细胞的影响

1、实验分组：实验共分为四组，每组四只小鼠。四组分别为pbs组、tlr9组、oct4-3组、oct4-3+tlr9组。小鼠为雄性balb/c小鼠(4周龄～6周龄)，并根据深圳实验动物单位发布的指南在无菌条件下饲养。

2、免疫后小鼠的制备：

(1)初次免疫(即d0)：pbs组的小鼠注射ph为7.2～7.4的pbs缓冲液，每只注射100μl。tlr9组的小鼠注射tlr9，每只注射50μl。oct4-3组的小鼠注射oct4-3-klh，每只注射100μl。oct4-3+tlr9组的小鼠注射oct4-3-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。各组小鼠注射后均在无菌条件下饲养。给药途径为腹腔注射。

(2)二次免疫(即d14)：在初次免疫之后，于第14天按照上述操作对各组初次免疫的小鼠进行二次免疫。

(3)三次免疫(即d21)：在初次免疫之后，于第21天按照上述操作对各组二次免疫的小鼠进行三次免疫。

(4)加强免疫(即d28)：在初次免疫之后，于第28天按照上述操作对各组三次免疫的小鼠进行加强免疫，得到免疫后的小鼠。

3、oct4-3-klh对肿瘤细胞的影响

(1)将小鼠睾丸畸胎瘤f9细胞(即f9细胞)在37℃、5％co2环境中培养。培养基为与实施例3的步骤3中的相同：向dmem培养基中添加体积百分含量为10％的热灭活的fbs(胎牛血清)、100u/ml的青霉素(购于invitrogen，carlsbad，ca)和100μg/ml的链霉素(购于invitrogen，carlsbad，ca)，得到培养基。用胰蛋白酶(购于hyclone公司)消化处于指数生长期的小鼠睾丸畸胎瘤f9细胞，用4℃的ph为7.3的pbs缓冲液洗涤两次。用4℃的ph为7.3的pbs缓冲液将洗涤后的细胞重悬，得到重悬液，重悬液中细胞浓度为2×10⁶个/ml。

(2)给上述各组的免疫后小鼠注射重悬液，注射量为2×10⁶个f9细胞/只。各组小鼠注射后均在无菌条件下饲养；饲养10天(即注射重悬液后饲养10天)后，每隔两天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和宽径(b)，并计算肿瘤体积(v)，测定结果详见图4。图4为实施例4中pbs组、tlr9组、oct4-3组、oct4-3+tlr9组小鼠的肿瘤体积的对比图。

从图4可以看出，oct4-3组的肿瘤体积小于与pbs组，说明仅注射oct4-3抗原表位肽能够抑制肿瘤的生长。oct4-3+tlr9组的肿瘤体积明显小于tlr9组和oct4-3组，说明oct4-3抗原表位肽与tlr9的协同作用能够进一步抑制肿瘤的生长。

实施例5

oct4抗原表位肽对小鼠寿命的影响

1、实验分组：

实验共分为六组，每组7只小鼠。六组分别为pbs组、klh组、tlr9组、oct4-1组、oct4-2组、oct4-3组。小鼠为雄性balb/c小鼠(4周龄～6周龄)，并根据深圳实验动物单位发布的指南在无菌条件下饲养。

2、免疫后小鼠的制备：

(1)初次免疫(即d0)：pbs组的小鼠注射ph为7.3的pbs缓冲液，每只注射100μl。klh组的小鼠注射klh，每只注射100μl。tlr9组的小鼠注射tlr9，每只注射50μl。oct4-1组的小鼠注射oct4-1-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。oct4-2组的小鼠注射oct4-2-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。oct4-3组的小鼠注射oct4-3-klh，每只注射100μl，并同时给每只小鼠注射50μl的tlr9。各组小鼠注射后均在无菌条件下饲养。给药途径为腹腔注射。

(2)二次免疫(即d14)：在初次免疫之后，于第14天按照上述操作对各组初次免疫的小鼠进行二次免疫。

(3)三次免疫(即d21)：在初次免疫之后，于第21天按照上述操作对各组二次免疫的小鼠进行三次免疫。

(4)加强免疫(即d28)：在初次免疫之后，于第28天按照上述操作对各组三次免疫的小鼠进行加强免疫，得到免疫后的小鼠。

3、oct4抗原表位肽对小鼠寿命的影响检测

(1)小鼠睾丸畸胎瘤f9细胞(即f9细胞)在37℃、5％co2环境中培养，培养基为：向dmem培养基中添加体积百分含量为10％的热灭活的fbs(胎牛血清)、100u/ml的青霉素(购于invitrogen，carlsbad，ca)和100μg/ml的链霉素(购于invitrogen，carlsbad，ca)，得到培养基。

(2)用胰蛋白酶(购于hyclone公司)消化处于指数生长期的小鼠睾丸畸胎瘤f9细胞，用4℃的ph为7.3的pbs缓冲液洗涤两次。用4℃的ph为7.3的pbs缓冲液将洗涤后的细胞重悬，得到重悬液，重悬液中细胞浓度为2×10⁶个/ml。

给上述各组的免疫后小鼠注射重悬液，注射量为2×10⁶个f9细胞/只。各组小鼠注射后均在无菌条件下饲养。饲养10天后，每隔2天～3天记录存活小鼠的个数，并计算存活率。测定结果详见图5。图5为实施例5中pbs组、klh组、tlr9组、oct4-1组、oct4-2组及oct4-3组的小鼠存活率对比图。

从图5可以看出，在相同培养时间下，oct4-3组小鼠的存活率明显优于oct4-1组，说明oct4-3能够有效地延长患癌小鼠的生存时间，以延长患癌小鼠的寿命。

综上所述，上述实施方式的oct4抗原表位肽能够有效地抑制睾丸癌细胞的生长，以延长睾丸癌患者的寿命，从而能够应用于制备抑制睾丸癌细胞生长的药物或延长睾丸癌患者的药物中。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>深圳大学

<120>oct4抗原表位肽、抗原偶联物及其制备方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>33

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gluasnargvalargglyasnleugluasnleupheleuglncyspro

151015

lysprothrleuglnglnileserhisilealaglnglnleuglyleu

202530

glu

<210>2

<211>32

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

glualaalaglyserpropheserglyglyprovalserpheproleu

151015

alaproglyprohispheglythrproglytyrglyserprohisphe

202530

<210>3

<211>27

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aspasnasngluasnleuglngluilecyslysalagluthrleuval

151015

glnalaarglysarglysargthrserileglu

2025