从肿瘤样品中分离单细胞的方法与流程

本发明涉及单细胞分离领域，具体涉及从肿瘤样品中分离单细胞的方法。

背景技术：

胰腺是人体中兼具内分泌和外分泌功能的器官。组织学上包含胰岛细胞、腺泡细胞、导管细胞以及间质细胞等多个细胞组分。胰腺产生分泌的胰液中含有胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等多种消化酶。随着近年来单细胞分析技术的兴起，人们对与人体组织器官的研究从不同成分混合，互相干扰的整体组织分析逐渐深入到对构成组织器官的单个细胞的研究，其重要性不言而喻。而在胰腺研究领域，由于胰腺器官大体上柔软而脆弱、组织学上成分复杂且因为强效的胰酶而容易发生自身消化，使得胰腺单细胞研究往往止步于第一步——也即可供分析的胰腺组织单细胞的获取。

人体或动物模型组织器官单细胞分离方法，从最初的毛细管吸取，到流式分选再到微流体技术，众多的单细胞分离技术在不同的组织当中或多或少都取得了较为满意的结果，但在胰腺组织上则差强人意。通过查阅文献可知，目前研究人员在分离小鼠胰腺癌单细胞时，大多采用以ii型胶原酶为主的酶消化解离方法，但是，胰腺单细胞研究者均表示在胰腺单细胞分离时遇到了极大的挑战，要么单细胞收率不高，要么细胞活率较低，因此，开发能够有效分离的胰腺单细胞的制剂或方法具有极为重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的单细胞收率和细胞活率较低的问题，提供一种新的从肿瘤样品中分离单细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种从肿瘤样品中分离单细胞的方法，该方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有viii型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述viii型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:0.1-20:500-100000:1。

通过上述技术方案，本发明能够在总消化时间较短的情况下实现单细胞的高收率和高活率提取，特别是基于胰腺组织的单细胞分离，攻克了现有胰腺组织单细胞收率和活率均较低的难题，为胰腺组织单细胞的分离指明了方向，有利于促进对胰腺组织的进一步研究。

附图说明

图1和图2是使用根据本发明具体实施方式的方法从胰腺组织分离单细胞的结果图；

图3至图5分别是使用不同的参比方法从胰腺组织分离单细胞的结果图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力单位”反应的是酶含量的多少，指在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活力单位(iu，又称u)。

其中，viii型胶原酶的酶活力单位的定义是：在ph7.5和37℃的条件下，5h内水解胶原产生相当于1μmol的l-亮氨酸的酶量为一个酶活力单位。

中性蛋白酶的酶活力单位的定义是：在ph7.5和37℃的条件下，每分钟水解酪蛋白产生相当于1μmol酪氨酸的folin阳性氨基酸或肽的酶量为一个酶活力单位。

胰蛋白酶抑制剂的酶活力单位的定义是：能抑制一个胰蛋白酶酶活力单位的活力称为一个抑制剂酶活力单位(u)，在ph7.5和25℃的条件下，每秒钟水解1μmol的n-苯甲酰-l-精氨酸乙酯(baee)为一个胰蛋白酶酶活力单位。

脱氧核糖核酸酶的酶活力单位的定义是：在ph8.0和37℃的条件下，10分钟内能够完全降解1μg的pbr322质粒dna所需的酶量为一个酶活力单位。

本发明提供的从肿瘤样品中分离单细胞的方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有viii型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶。

所述方法中，viii型胶原酶与脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:1，优选为50-625:1，如50:1、80:1、100:1、105:1、110:1、120:1、130:1、150:1、180:1、200:1、220:1、240:1、260:1、280:1、300:1、310:1、312:1、315:1、320:1、400:1、450:1、500:1、550:1、600:1、610:1、620:1、625:1或上述数值之间的任意值。

所述方法中，中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为0.1-20:1，优选为0.5-10:1，如0.5:1、1:1、1.2:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、4.8:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或上述数值之间的任意值。

所述方法中，胰蛋白酶抑制剂与脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为500-100000:1，优选为2000-50000:1，如2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、5500:1、6000:1、8000:1、9000:1、10000:1、12000:1、15000:1、18000:1、20000:1、22000:1、24000:1、25000:1、30000:1、35000:1、40000:1、45000:1、48000:1、50000:1或上述数值之间的任意值。

胶原酶是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内。胶原酶主要由溶组织梭状芽孢杆菌经发酵培养，提取、精制而得，也可以从猪胰脏中提取而得。本发明中，所述胶原酶为viii型胶原酶，例如，可以为sigma的cat:c2139。

本发明中，对中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶的具体种类没有特别的要求，可以为本领域常见的各种选择。

优选地，所述中性蛋白酶为dispaseii。例如，roche的cat:4942078001。

优选地，所述脱氧核糖核酸酶为dnasei。例如，neb的cat:m0303s。

本发明中，胰蛋白酶抑制剂能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活，可以选择本领域常规使用的胰蛋白酶抑制剂。例如，sigma的cat:t6522。

本发明中，所述消化液含有溶剂。相对于每毫克的viii型胶原酶，所述溶剂的含量可以为0.1-12.5ml，优选为0.2-3ml，如0.2ml、0.4ml、0.5ml、0.8ml、1ml、1.2ml、1.3ml、1.5ml、2ml、2.5ml或上述数值之间的任意值。

本发明中，所述溶剂可以为各种常见的保存或溶解酶制剂的试剂，优选地，所述溶剂为含有4-10体积％胎牛血清的磷酸盐缓冲液。

本发明中，对所述消化液的用量没有特别的要求，只要能够浸没所述样品即可。优选情况下，相对于体积为1cm³的肿瘤样品，所述消化液的用量为20-45ml，如20ml、25ml、26ml、27ml、28ml、30ml、32ml、35ml、40ml、45ml或上述数值之间的任意值。

本发明中，为了更好地进行消化，所述肿瘤样品的体积优选是1-2cm×1-2cm×0.5-2cm，如1.5cm×1.5cm×0.5cm。

本发明中，所述消化可以在常规条件下进行。优选地，所述消化的条件包括温度为35-38℃，如35℃、36℃、36.5℃、36.8℃、37℃、37.2℃、37.5℃、38℃或上述数值之间的任意值。

优选地，所述消化的条件还包括时间为5-80min，如5min、10min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min或上述数值之间的任意值。

所述消化可以在摇床上进行，优选地，所述消化的条件进一步包括振动速率为40-60rpm/min。

本发明中，为了进一步加快黏连成团的样品消化，可以剪切样品和/或借助吸管(如无菌布氏吸管)吹打样品。也可以消化一段时间后经细胞筛过滤，再往未消化的样品中补加消化液继续消化。也即，所述消化的方式可以为：将样品与第一部分消化液混合，剪切样品，并将剪切后的样品与第二部分消化液混合，吹打样品，过细胞筛，未消化的样品补加消化液继续消化，过细胞筛，并合并两次过细胞筛的滤液。相对于体积为1cm³的肿瘤样品，第一部分消化液的用量可以为400-1000μl。相对于体积为1cm³的肿瘤样品，第二部分消化液的用量可以为10-20ml。相对于体积为1cm³的肿瘤样品，补加的消化液的用量可以为10-20ml。

本发明中，为了进一步促进消化的进行，所述方法还包括：在消化前，于组织保存液中去除肿瘤样品的纤维、脂肪和坏死组织。

其中，对所述组织保存液的用量没有特别的要求，只要能够浸没所述样品即可。所述组织保存液可以为常规选择，例如，可以为含有胎牛血清和蛋白酶抑制剂的无血清细胞冻存培养基。

本发明中，所述方法还包括：将消化后的样品与红细胞裂解液接触从而裂解红细胞，洗涤后获得分离的单细胞。消化后的样品为细胞悬浮液，经离心分离取沉淀，沉淀与红细胞裂解液接触以去除红细胞。所述红细胞裂解液的用量可以为常规选择，例如，相对于体积为1cm³的肿瘤样品，所述红细胞裂解液的用量可以为3-8ml。洗涤所使用的洗液也可以为常规选择，例如，可以为含有0.02-0.08重量％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液。对所述洗液的用量没有特别的限制，例如，相对于体积为1cm³的肿瘤样品，所述洗液的用量可以为3-8ml。

根据本发明一种具体的实施方式，所述方法包括以下步骤：

1)在组织保存液中，用无菌眼科剪修剪掉肿瘤样品上的纤维、脂肪和坏死组织等；

2)无菌pbs洗涤；

3)将样品放入无菌离心管中，加入第一部分消化液(相对于体积为1cm³的肿瘤样品，第一部分消化液的用量可以为400-1000μl)；

4)使用无菌眼科剪将组织剪成碎屑(约2×2×1mm³)，冰上操作，剪切时间不超过5分钟；

5)将组织碎屑转移至无菌管内，加入第二部分消化液，置于摇床上进行消化(相对于体积为1cm³的肿瘤样品，第二部分消化液的用量可以为10-20ml)；

6)使用无菌布氏吸管将黏连成团的组织碎屑吹打混匀；

7)继续消化后观察组织碎屑状态，若仍黏连成团，则重复步骤6)-7)，若组织碎屑分散，则继续消化，总消化时间不超过30min；

8)消化完毕，再次使用无菌布氏吸管吹打组织碎屑后静置，收集上清过细胞筛，得滤液置于冰上；

9)未消化的组织补加消化液(相对于体积为1cm³的肿瘤样品，补加的消化液的用量可以为10-20ml)，继续消化，使用无菌布氏吸管吹打组织碎屑，连同消化液与组织碎屑过细胞筛，得滤液；

10)合并两次获得的滤液，离心；

11)弃上清，加入红细胞裂解液轻柔吹打，重悬沉淀，室温下避光裂红，若有絮状难溶物，则再次过细胞筛去除；

12)将重悬液转移至无菌离心管中离心；

13)弃上清，加入第一部分洗液轻柔吹打重悬沉淀，若有絮状难溶物，则再次过细胞筛去除，将重悬液转移至新的无菌离心管并继续加入第二部分洗液(第一部分洗液与第二部分洗液的体积比可以为1:4-5)；

14)离心；

15)重复步骤13)；

16)离心。

本发明中，所述方法还可以包括使用细胞培养基对消化所得的单细胞进行培养。所述细胞培养基可以为使细胞扩增的常规培养基，也可以为含有生长因子的三维培养基，以使获得的单细胞生长为三维类器官模型。

本发明中，所述肿瘤样品可以为常见的肿瘤样品，可以为胰腺样品，例如胰腺来源的肿瘤组织。本发明的方法特别适用于从胰腺样品中分离单细胞，因此，根据本发明的优选实施方式，所述肿瘤样品为胰腺肿瘤样品(胰腺肿瘤组织)。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

表1

表2

实施例1

本实施例用来说明本发明的从正常胰腺组织(肿瘤所在部位的正常胰腺)分离单细胞的方法，其中，所使用的组织保存液、消化液、裂解液和洗液如表1所示，每升消化液中各个成分的酶活力单位值和浓度如表2所示，且消化液的配制方法为：混合viii型胶原酶、dispaseii和胰蛋白酶抑制剂，使用溶剂溶解混合粉剂，再加入dnasei混匀。

样品被分成五组进行实验(见表3)，具体操作步骤如下：

1)在组织保存液中，用无菌眼科剪修剪掉标本上的纤维、脂肪和坏死组织等(正常胰腺组织块大小约1.5×1.5×0.5cm³，色黄，质地中等偏软，表面无黑焦坏死、太多血液，切面可见清晰的胰腺小叶分隔，来源于胰腺肿瘤患者，手术切取获得，患者已签署知情同意书)。

2)无菌pbs洗涤3次。

3)将样品放入5ml无菌ep管(eppendorf)中，加入消化液约500μl。

4)使用无菌眼科剪将组织剪成碎屑(约2×2×1mm³)，冰上操作，剪切时间不超过5分钟。

5)将组织碎屑转移至10cm无菌培养皿中，加入10ml消化液，置于37℃孵箱消化。

6)每隔5min使用无菌布氏吸管吹打混匀一次，并于10×20、10×40倍显微镜下观察细胞解离情况。第一个10min时在显微镜下即可见到消化液中有单个细胞悬浮，将消化液连同组织碎屑收集到无菌50ml离心管中，轻柔吹打后静置，收集上清过40μm细胞筛(cellstrainer)，取滤液。未消化的组织碎屑补加消化液10ml在10cm无菌培养皿中继续消化，直至组织消化完全或得到满意的胰腺正常组织单细胞(共持续50min)，将第一个10min收集的滤液弃之不用，因其含有较多杂质，分离单细胞困难。以后每10min消化得到的滤液可分别留存，分别进行后述操作步骤，最终选取活率、细胞数量最佳的单细胞悬液样品。

7)将步骤6)中得到的滤液800g离心4min(使用水平转子)。

8)弃上清，加入5ml裂解液轻柔吹打，重悬沉淀，室温下避光裂红5min(若有絮状难溶物，则再次过40μm细胞筛去除)。

9)将重悬液转移至无菌15ml离心管中离心，离心力：800g，时间：4min。

10)弃上清，加入1ml洗液轻柔吹打重悬沉淀(若有絮状难溶物，则再次过40μm细胞筛去除)，将重悬液转移至一个新的无菌15ml离心管并继续加入5ml洗液。

11)600g离心5min。

12)重复步骤10)。

13)400g离心6min。

14)弃上清，适量洗液重悬沉淀(覆盖15ml离心管底部的沉淀，使用100μl洗液重悬)，取等体积细胞与台盼蓝混匀，镜检细胞形态、活率、杂质情况等，细胞计数仪(lifecellcountess)检测细胞活率(＝每ml产物中活细胞数量占细胞总数的百分比)与浓度(每ml产物中的细胞总数，包括死细胞)，结果如图1-5和表3所示。

图1-5中，上图为消化后在普通光学显微镜(40×)下观察消化效果的结果图，下图为进一步稀释后在普通光学显微镜(40×)下观察细胞活率的结果图。

表3

从图1、图2和表3可以看出，使用本发明的方法能够有效地从正常组织中分离单细胞，基本无团聚，细胞活率均较高。特别地，比较图1和图2的结果可以看出，控制所述viii型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值在100-312.5:1-5:5000-25000:1范围内能够进一步改善团聚现象，细胞活率也将提高到85％以上。

从图3和表3可以看出，如果消化液中各个组分之间的比值不在本发明的范围内，消化后细胞存在团聚，细胞活率也较低。

从图4和表3可以看出，使用viii型胶原酶能够获得比其它类型的胶原酶明显更多的单细胞且细胞活率也更高。

从图5和表3可以看出，只有配合使用viii型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶才能够有效提高单细胞数量(团聚少)和细胞活率，四种成分缺一不可，协同发挥作用。

实施例2

本实施例用来说明本发明的从胰腺来源肿瘤组织分离单细胞的方法，其中，所使用的组织保存液、消化液、裂解液和洗液如表1所示，每升消化液(配制方法同实施例1)中各个成分的酶活力单位值和浓度如表2的i-1所示。

17)在组织保存液中，用无菌眼科剪修剪掉胰腺肿瘤样品(1.5×1.5×0.5cm³，手术切取获得，患者已签署知情同意书)上的纤维、脂肪和坏死组织等。

18)无菌pbs洗涤3次。

19)将样品放入5ml无菌ep管(eppendorf)中，加入消化液约500μl。

20)使用无菌眼科剪将组织剪成碎屑(约2×2×1mm³)，冰上操作，剪切时间不超过5分钟。

21)将组织碎屑转移至50ml无菌管内，加入15ml消化液，置于37℃、50rmp/min的摇床上消化。

22)5min后使用无菌布氏吸管将黏连成团的组织碎屑吹打混匀。

23)继续消化5min后观察组织碎屑状态，若仍黏连成团，则重复步骤6)-7)，若组织碎屑分散，则继续消化20min，总消化时间不超过30min。

24)消化完毕，再次使用无菌布氏吸管吹打组织碎屑后静置3min，收集上清过40μm细胞筛(cellstrainer)，得滤液置于冰上。

25)未消化的组织补加15ml消化液，继续消化20min后，使用无菌布氏吸管吹打组织碎屑，连同消化液与组织碎屑过40μm细胞筛，得滤液。

26)合并两次获得的滤液，800g离心4min(使用水平转子)。

27)弃上清，加入5ml裂解液轻柔吹打，重悬沉淀，室温下避光裂红5min(若有絮状难溶物，则再次过40μm细胞筛去除)。

28)将重悬液转移至无菌15ml离心管中离心，离心力：800g，时间：4min。

29)弃上清，加入1ml洗液轻柔吹打重悬沉淀(若有絮状难溶物，则再次过40μm细胞筛去除)，将重悬液转移至一个新的无菌15ml离心管并继续加入5ml洗液。

30)600g离心5min。

31)重复步骤13)。

32)400g离心6min。

33)弃上清，适量洗液重悬沉淀(覆盖15ml离心管底部的沉淀，使用100μl洗液重悬)，取等体积细胞与台盼蓝混匀，镜检细胞形态、活率、杂质情况等，细胞计数仪(lifecellcountess)检测细胞活率与浓度，结果与实施例1类似，使用本发明的方法能够有效地从肿瘤组织中分离单细胞，基本无团聚，细胞活率较高；而如果消化液中各个组分之间的比值不在本发明的范围内，消化后细胞存在团聚，细胞活率也较低；且使用viii型胶原酶能够获得比其它类型的胶原酶明显更多的单细胞且细胞活率也更高。另外，在缺少一种成分的情况下，单细胞数量和细胞活率均不理想，进一步说明四种成分缺一不可，协同发挥作用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。