精子特异miRNAs在辅助生殖体外受精诊断中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种精子特异mirnas在辅助生殖体外受精诊断中的应用。

背景技术：

micrornas(mirnas)是一类小的、单链非编码小rna(smallnoncodingrnas,sncrnas)，长度为20-23nt，可以通过与靶mrna的3’utr的不完全配对，在转录后水平介导基因沉默，从而实现翻译抑制或是靶mrnas的降解。目前，mirnas是研究较多的一类sncrnas，许多研究证实mirnas可以作为精子质量预测及诊断的潜在生物标志物。在非梗阻性无精子症(noa,non-obstructiveazoospermia)患者睾丸内mirnas的表达发生改变，意味着mirnas可在精子发生过程中发挥作用。对少弱精症患者精子进行microarray检测，发现许多mirnas的表达发生变化，进一步的生物信息学分析表明，它们可能参与精子发生过程。此外，还有研究发现，在无精症患者精浆内，有3个mirnas(mir-141,mir-429,mir-7-1-3p)的表达发生变化，它们可能参与noa相关的甲基化-mirna-基因调控网络。这些结果表明，mirnas在雄性生殖系统中发挥重要作用，但其目前尚未有mirna对正常精子的评估及预测。

现有对辅助生殖体外受精(invitrofertilization，ivf)过程中精子生育力预测的技术手段和方法，主要集中在检测精液参数、精液ros值、精子dna碎片率等。但是，现有的方法仅检测精子相关参数，没有和胚胎质量相关联，无法全面、真实、准确地评估精子生育力。因此现有的方法仅对精子质量做出判断，但对精子的生育力评价不足，临床上ivf的成功率仅为30％左右，成本高(在生殖中心进行一次ivf花费约在3万人民币左右)等。

技术实现要素：

本发明选取ivf病人中正常男性精液样本87例，通过对精液样本进行优化以及精液质量检测，选取符合标准的正常精子样本，根据其对应优质胚胎率(goodqualityembryo，gqe)情况，分为h-gqe((gqe≥75％，high，h-gqe，n＝23；gqe≤25％，low，l-gqe，n＝64)，然后进行精子rna提取，最后对通过小rna高通量测序方法检测mirnas表达水平。通过小rna高通量测序后，共检测到389个mirnas，并分析两组表达差异后，共得到4个差异表达mirnas。最后通过数据分发现，这4个mirnas对87例样本的区分效率可以达到71.54％。

因此，本发明的首要目的是提供精子特异mirnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂中的应用。本发明的第二个目的是提供精子特异mirnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂盒中的应用。本发明的第三个目的是提供精子特异mirnas在制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，精子特异mirnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂中的应用，所述精子特异mirnas为hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p或hsa-mir-29a-3p中的一种或几种。

根据本发明，所述诊断试剂为检测生物样品中hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和/或hsa-mir-29a-3p在低优质胚胎率中的特异性低表达或特异性高表达情况。

作为本发明的第二个方面，精子特异mirnas在制备辅助生殖体外受精的诊断试剂盒中的应用，所述精子特异mirnas为hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p或hsa-mir-29a-3p中的一种或几种。

根据本发明，所述诊断试剂盒包含了检测生物样品中hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和/或hsa-mir-29a-3p在低优质胚胎率中的特异性低表达或特异性高表达的试剂。

作为本发明的第三个方面，精子特异mirnas在制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物的应用，所述精子特异mirnas为hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p或hsa-mir-29a-3p中的一种或几种。

本发明的有益效果是：hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p或hsa-mir-29a-3p可以作为精子特异性的分子标志物用于预测精子生育力，从而为ivf中的男性不育治疗以及临床诊断提供可靠的科学依据与个性化治疗的思路，具体体现在：

1、由于精子特异mirnas可以在l-gqe中特异性低表达或特异性高表达，因此可以通过制备辅助生殖体外受精的监测试剂、诊断试剂或者制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物，结合高通量测序的方法进行检测，其检测结果更为真实、全面、可靠；

2、精子特异mirnas作为制备辅助生殖体外受精的监测试剂、诊断试剂或者制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物，可以检测精子中的mirna表达水平，从胚胎质量的角度对精子的生育力进行预测，而不仅仅是精子质量，患者获得高优质胚胎率的可能性可以达到71.54％，因此采用上述的监测试剂、诊断试剂或者分子标志物可以及早地发现潜在的男性不育靶点，并进行个性化的干预和治疗，并最终提高ivf的生育结局；

3、精子特异mirnas作为制备辅助生殖体外受精的监测试剂、诊断试剂或者制备用于预测或评估辅助生殖体外受精过程中精子生育力的分子标志物，可以在ivf治疗开始时，即对精子样本进行检测，并可进行相应的个性化的治疗与干预，可降低患者诊疗成本。

附图说明

图1为实施例1的操作流程图。

图2为实施例1的mirnas高通量测序结果图。

图3为实施例1的特异性表达mirnas高通量测序的结果图。

图4为4个mirnas对87例样本的区分效率的示意图，其中横坐标tpr为truepositiverate，真正确率；纵坐标fpr为falsepositiverate，假正确率。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

为了便于研究精子mirnas作为精子特异性分子标志物，本实施例选取接受ivf治疗的正常精子样本，根据其对应的优质胚胎率(gqe率)将其分为高gqe(≥75％；highrateofgqe,h-gqe)组与低gqe组(≤25％；lowrateofgqe,l-gqe)，分析mirnas变化与优质胚胎率之间的关系，寻找可以作为男性不育检测指标的mirnas。

实施例1

本实施例的操作流程图如图1所示。

1、样本入组情况

本实施例纳入首次接受ivf治疗的病人，并女方年龄在23-40岁之间，没有多囊卵巢综合症、异位妊娠症、卵巢早衰等疾病；男方年龄在24-50岁之间，没有生殖系统疾病。双方均汉族，且没有其他疾病。其中，女性患者在年龄、获卵数、及其mⅱ期(metaphaseⅱstage)的卵细胞数上均无显著性差异。对应男性患者的年龄、精子密度、精子存活率、以及精子(前向)活动率(a+b级精子)均无显著性差异，但精子形态略有差异(p<0.05)。

2、精液样本的分组

选取ivf病人中正常男性精液样本87例，根据其对应的gqe情况，将精液样本分为h-gqe组(≥75％)，l-gqe组(≤25％)，其中，高优质胚胎率组(h-gqe)，共23例，低优质胚胎率组(l-gqe)，共64例。

其中，h-gqe组与l-gqe组相比，其对应2pn(合子发育至2细胞阶段，twopronucleistage)的数目(p<0.05)、可移植胚胎数(p<0.001)、受精率(p<0.05)、有效胚胎率(p<0.001)、优质胚胎率(p<0.001)均存在显著性差异。

因此，h-gqe组内胚胎发育较好，其对应的精子生育力较好，l-gqe组内胚胎发育质量较差，对应精子生育力较差。

3、精液样本的采集

研究对象禁欲3-7天，通过手淫法获得全份精液，置于37℃水浴孵育30min，液化后待用。

4、精液样本的优化

按照who人类精液实验室检验手册(第5版)，通过精子上游法对精液样本进行优化。

5、精液常规检测

按照who人类精液实验室检验手册(第5版)，通过casa系统对优化后的精液样本进行精液常规参数检测，选取符合标准的正常精子样本入组。

6、精液样本的rna提取

选取优化过的精子(约2×10⁶)重悬于1mltrizol(invitrogen公司购买)中，并进行rna抽提(方法参照trizol产品使用说明)。

7、小rna高通量检测精子mirnas

每个样品选取100ng总rna进行小rna高通量测序(方法参考文献yangq,linj,lium,etal.highlysensitivesequencingrevealsdynamicmodificationsandactivitiesofsmallrnasinmouseoocytesandearlyembryos.sciadv.2016,10；2(6):e1501482.)。共检测到389个mirnas，分为h-gqe与l-gqe组，然后利用软件进行实验与分析。其中，表达量较高的前100个mirnas的表达情况可见图2，如hsa-mir-99a-5p，hsa-mir-10a-5p，hsa-mir-10b-5p，hsa-mir-21-5p，hsa-mir-16-5p等表达量均很高，但是两组表达差异并不显著。

差异表达分析结果如图3所示，hsa-mir-191-5p，hsa-mir-499a-5p，hsa-mir-132-3p在l-gqe组中特异性低表达，hsa-mir-29a-3p则在l-gqe组中特异性高表达。

结论：hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和hsa-mir-29a-3p可以用于预测精子生育力。因此，这些样本对应的男性患者有必要进行个性化的男性不育诊疗，以期改善ivf的生育结局。

实施例2

通过支持向量机(supportvectormachines，svms)的方法进一步进行数据分析，这4个mirnas(hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和hsa-mir-29a-3p)对实施例1的87例样本的区分效率可以达到71.54％。结果如图4所示。

结论：采用本发明的方法，患者获得高优质胚胎率的可能性为71.54％，可有效提高患者ivf成功率。

综上所述，本发明的4个mirnas(hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和hsa-mir-29a-3p)可以作为精子特异性的分子标志物用于预测精子生育力，从而为ivf中的男性不育治疗以及临床诊断提供可靠的科学依据与个性化治疗的思路。而且。hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和hsa-mir-29a-3p可采用本领域中已知的方法，进一步制成诊断试剂或诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括检测生物样品中hsa-mir-191-5p、hsa-mir-499a-5p、hsa-mir-132-3p和/或hsa-mir-29a-3p在低优质胚胎率中的特异性低表达或特异性高表达的试剂，还可以包括精子优化相关试剂(bww，htf等)、rna提取试剂trizol等，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。