本发明属于化妆品领域，具体涉及一种具有紧致皮肤功效的低分子量蜂毒多肽及其制备方法与应用。
背景技术：
皮肤是人体最大的器官，具有保护、感觉、体温调节、分泌、排泄和免疫等诸多重要的功能。但是随着年龄的增长，人体皮肤成纤维细胞的衰老及生物学特性的改变会导致皮肤松弛、皱纹的出现。
蜂毒是由蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌出的毒液。几个世纪前，在印度、埃及和叙利亚的民间医学中，就有利用蜂毒疗法治疗风湿热的先例。目前，蜂毒制剂已经先后在德国、英国、西班牙、日本等国作为上市药品进入临床应用，剂型主要有注射液、粉针、外用软膏等，我国目前有蜂毒注射液、蜂毒冻干粉针剂两种蜂毒制剂的生产和临床应用。蜂毒是一种成分复杂的混合物，主要包含水分、酶、多肽、生物活性胺、游离氨基酸、外激素以及其他挥发性成分。目前，对蜂毒研究最广泛的是其中的蜂毒肽和其中的脂溶性成分，这些成分占蜂毒干重的50％以上，是蜂毒中的主要功能性成分。对于蜂毒多肽，现阶段的获取方式主要是从蜂毒中直接分离得到，分子量较大(蜂毒中多肽的分子量分布在2.5kda-46kda之间，目前获取蜂毒多肽主要采用色谱技术进行分离纯化，小分子量肽的含量在10％左右)。
本发明利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对蜂毒进行处理，获得的蜂毒多肽分子量更小，而且本发明获得蜂毒多肽能够较好的促进皮肤胶原蛋白的合成，对紧致皮肤具有非常好的功效。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种具有促进皮肤胶原蛋白合成、紧致皮肤功效的低分子量蜂毒多肽及其制备方法。本发明的方法简单，所获得蜂毒多肽分子量低，能够较好的促进皮肤胶原蛋白的合成，对紧致皮肤具有非常好的功效。并且本发明的方法使得低分子量多肽的得率高。
本发明的另一目的在于提供上述低分子量蜂毒多肽的应用。所述低分子量蜂毒多肽用于制备化妆品，特别是紧致肌肤的化妆品。包括膏剂、乳霜、贴剂、涂剂等，但不限于这些种类。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有紧致皮肤功效的低分子量蜂毒多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蜂毒与水混合均匀，离心，取上清液；所述蜂毒与水的质量比为10g：(20～30)g，所述离心的转速为5000～8000r/min，离心的时间为20～30min；
(2)调节上清液的ph为7～9，加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，酶解，灭酶，获得酶解液；
(3)将酶解液冷却，浓缩，超滤，滤液浓缩，干燥，获得低分子量蜂毒多肽。
步骤(2)中所述调节上清液的ph的物质为碱液；所述碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为(2～4)：1，所述碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶总的添加量为蜂毒质量的0.1％～2％；
步骤(2)中所述酶解的条件：酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为2～4h，酶解时的转速为50～200r/min；所述灭酶是指煮沸10～15min。
步骤(2)中上清液在调节ph前需进行预热处理，预热的温度为50～60℃，预热的时间为10～15min；
步骤(3)中浓缩的温度为40～50℃；超滤所采用的超滤膜为分子量为3000da的超滤膜，截留物的分子量大于3000da。
步骤(2)中所述的ph优选为8；所述碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比优选为3.5：1；所述碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶总的添加量优选为蜂毒质量的2％。
步骤(3)中所述干燥为冷冻干燥。
所述低分子量蜂毒多肽通过上述方法制备得到。
所述低分子量蜂毒多肽用于制备化妆品，特别是紧致肌肤的化妆品。包括膏剂、乳霜、贴剂、涂剂等，但不限于这些种类。
本发明制备的小分子量的蜂毒多肽，能够有效促进皮肤成纤维细胞的增殖，ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白的表达，从而起到改善皱纹程度和紧致皮肤的功能。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
本发明的方法简单，所获得蜂毒多肽产率高(达到65％以上)，分子量小(在500da～3000da之间)，能够更好地促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成，具有更好的紧致肌肤的功效。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所述的粗蜂毒为蜜蜂粗蜂毒或/和胡蜂粗蜂毒。
实施例1
(1)取粗蜂毒10g，添加30g的去离子水充分溶解，然后在7000rap/min条件下离心30min，弃去沉淀，收集上清液备用；
(2)将上述上清液在55℃水浴中预热10min，采用1m的naoh调节ph为8.0，随后向其中添加2％(w/w)(碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的总量为粗蜂毒质量的2％)的碱性蛋白酶(2×105u/g，河南金诚生物科技)和木瓜蛋白酶(1×105u/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为4:1，在55℃水浴摇床中酶解3h，酶解结束后煮沸10min，冷却至室温备用；
(3)采用旋转蒸发仪将步骤(2)中的水解液在50℃条件下浓缩，使其体积为原体积一半，随后用分子截留量为3000da的超滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩后冷冻干燥(冷冻干燥的温度为-40℃～-60℃)得到蜂毒多肽，其中多肽含量为68％(产率)，分子量为500-3000da。
实施例2
(1)取粗蜂毒10g，添加20g的去离子水充分溶解，然后在5000rap/min条件下离心20min，弃去沉淀，收集上清液备用；
(2)将上述上清液在50℃水浴中预热10min，采用1m的naoh调节ph为7.5，随后向其中添加0.5％(w/w)的碱性蛋白酶(2×105u/g，河南金诚生物科技)和木瓜蛋白酶(1×105u/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比3:1，在55℃水浴摇床中酶解2h，酶解结束后煮沸10min，冷却至室温备用；
(3)采用旋转蒸发仪将步骤(2)中的水解液在50℃条件下浓缩，使其体积为原体积一半，随后用分子截留量为3000da的超滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩后冷冻干燥，得到蜂毒多肽，其中多肽含量为72％(产率)，分子量范围为1500-3000da。
实施例3
(1)取粗蜂毒10g，添加25g的去离子水充分溶解，然后在8000rap/min条件下离心30min，弃去沉淀，收集上清液备用；
(2)将上述上清液在60℃水浴中预热15min，采用1m的naoh调节ph为9.0，随后向其中添加1％(w/w)的碱性蛋白酶(2×105u/g，河南金诚生物科技)和木瓜蛋白酶(1×105u/g，南宁东恒华道生物科技有限责任公司)，碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的质量比为2:1，在55℃水浴摇床中酶解4h，酶解结束后煮沸10min，冷却至室温备用；
(3)采用旋转蒸发仪将步骤(2)中的水解液在50℃条件下浓缩，使其体积为原体积一半，随后用分子截留量为3000da的超滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩后冷冻干燥，得到蜂毒多肽，其中多肽的含量为79％(产率)，分子量范围为1000-3000da。
对比例
(1)取粗蜂毒10g，添加25g的去离子水充分溶解，然后在6000rap/min条件下离心30min，弃去沉淀，收集上清液备用；
(2)将上述上清液用分子截留量为3000da的超滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩后冷冻干燥得到蜂毒多肽组合物，其中多肽的含量为37％，分子量范围为1500-3000da。
效果测试：
分别取实施例和对比例中制备的蜂毒多肽进行皮肤成纤维细胞实验，观察蜂毒多肽处理皮肤成纤维细胞24h、72h和120h后，对细胞的增殖、ⅰ型和ⅲ型胶原蛋白表达的影响。实验中蜂毒多肽组合物的浓度为10μg/ml，设置正常对照组(不添加蜂毒多肽)。结果见表1。
表1小分子量蜂毒多肽对皮肤成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成的影响
从表中结果可以看出：本发明制备的小分子量蜂毒多肽可以有效促进人体皮肤成纤维细胞的增殖以及i型和iii型胶原蛋白的合成，起到紧致皮肤的作用。