本发明涉及一种生物转化木质纤维素生物质合成1,6-二磷酸果糖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
果糖-1,6-二磷酸(fdp)又名1,6-二磷酸果糖，是生物体内糖酵解途径的一个重要代谢中间产物，通常作为药物广泛应用于医学。世界卫生组织药物统计学方法论合作中心将其分类为“其他心脏准备”(atc代码：c01eb07)。它的细胞保护活性在严重的条件下已经有记录，如惊厥、感染性休克、糖尿病并发症、低温诱导的损伤、紫外线引起的皮肤损伤以及其他过程，包括细胞凋亡和兴奋性毒性。临床数据表明，该化合物可用于治疗各种缺血性病症，例如，搭桥手术、心肌梗塞和移植器官保存。最近，已经发现减轻某些神经衰退型疾病如阿尔茨海默氏病和帕金森病的发展。
此外，fdp是通过使用fdp醛缩酶制备两个磷酸化的三碳单元：磷酸二羟丙酮(dhap)和甘油醛-3-磷酸(ga3p)的重要前体。dhap是由醛缩酶催化的c-c键形成反应的最重要的前体之一。立体选择性的c-c形成反应是生物合成各种精细化学品、药物中间体和有效成分(如稀有糖和糖化学物质)的有力工具。ga3p是用于治疗退行性疾病的潜在药物，并且是合成一些糖类磷酸酯衍生物的前体，如脱氧核糖-5-磷酸、木酮糖-5-磷酸磷酸盐、d-阿拉伯糖-5-磷酸、d-果糖-6-磷酸和类似物。
fdp可以通过几种方法合成，主要的方法是基于活酵母介导的磷酸化。这个过程使用来自啤酒厂的新鲜活酵母来利用葡萄糖和无机磷酸盐。用有机溶剂(例如甲苯)预处理酵母以增加其细胞壁的渗透性从而释放出合成的fdp(u.s.patent4,920,049)。但是这种高能中间体的处理和去除导致fdp生产时间短。还有一种生产方法，日本专家提出用于体外atp再生的过表达乙酸激酶的重组细菌(u.s.patent5,094,947)。然而，全细胞型生物催化剂具有产品回收率低、产品纯度低(形成大量发酵营养物和其他代谢物的混合物)以及高的产品分离成本。还有通过atp依赖性果糖激酶、磷酸果糖激酶和多磷酸激酶的三种酶级联反应途径从果糖和多磷酸盐生产fdp(appliedandenvironmentalmicrobiology,2007,73,5676-5678)。但是，这种方法受到需添加昂贵的atp的影响，尽管它可在体外再生，但atp在较高温度下不稳定，因此生物催化不能在高反应温度下进行。
由此可知，目前fdp的市场潜力较大，而生物法合成fdp仍然存在原料昂贵、效率较低等问题，不能满足工业化生产的需求。需要进一步开发高效的生物转化工艺。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明以廉价的木质纤维素生物质为初始材料，经过预处理、酶解和体外生物转化，最终合成fdp。该工艺具有原料来源广泛易得，无需atp参与，反应条件温和，操作简单等优点，实现了木质纤维素生物质的高价值利用。
本发明的第一个目的是提供一种生物转化木质纤维素生物质合成1,6-二磷酸果糖的方法，包括如下步骤：
(1)秸秆预处理：在110～150℃条件下，采用低共熔溶剂对秸秆进行处理，处理后进行固液分离，将得到的固体洗涤、烘干后，在20～100℃条件下，用碳酸钠溶液或次氯酸钠溶液浸泡处理，然后烘干得到预处理秸秆；
(2)酶法转化纤维素合成纤维二糖：将步骤(1)得到的预处理秸秆加入到缓冲溶液中，加入纤维素内切酶和纤维素外切酶进行酶解，得到纤维二糖；
(3)酶法转化纤维二糖合成1,6-二磷酸果糖：向步骤(2)的纤维二糖中加入纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶进行酶解，得到1,6-二磷酸果糖。
在本发明中，所使用的酶的ncbi登录号分别为：纤维素内切酶：cp000088.1；纤维素外切酶：cp000568.1；纤维二糖磷酸化酶：ay072794.1；葡萄糖磷酸变位酶：ap008226.1；磷酸葡萄糖异构酶：ap006878.1；磷酸果糖激酶：cp011108.1。
进一步地，所述的低共熔溶剂为氯化胆碱:甲酸:乙酸合成的低共熔溶剂或乙胺盐酸盐:乳酸合成的低共熔溶剂。
进一步地，所述的氯化胆碱、甲酸与乙酸的摩尔比为1:0.8～1.2:0.8～1.2。
进一步地，所述的乙胺盐酸盐与乳酸的摩尔比为1:0.8～1.2。
进一步地，所述的秸秆为水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣中的一种或一种以上组合。
进一步地，在步骤(1)中，所述的秸秆与低共熔溶剂的质量比为1:5～20。
进一步地，在步骤(1)中，所述的低共熔溶剂处理秸秆的时间为1～5h。
进一步地，在步骤(1)中，所述的碳酸钠/次氯酸钠的浓度为0.5～10％。
进一步地，在步骤(1)中，所述的碳酸钠溶液或次氯酸钠溶液浸泡的时间为1～10h。
进一步地，在步骤(2)中，所述的缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
进一步地，在步骤(2)中，所述预处理秸秆与缓冲溶液的质量比为1:5～20。
进一步地，在步骤(2)中，所述的纤维素内切酶的添加量为40～60u/g；纤维素外切酶的添加量为40～60u/g。
进一步地，在步骤(2)中，酶解反应的温度为45～55℃。
进一步地，在步骤(3)中，所述的纤维二糖磷酸化酶的添加量为90～110u/g；葡萄糖磷酸变位酶的添加量为40～60u/g；磷酸葡萄糖异构酶的添加量为40～60u/g；焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶的添加量为40～60u/g。
进一步地，在步骤(3)中，酶解反应的温度为45～55℃。
在本发明中，酶的添加量均是按照秸秆的质量进行添加。
进一步地，本发明的方法，具体包括如下步骤：
(1)秸秆预处理：在110～150℃条件下，按照质量比5～20:1，加入氢供体低共熔溶剂对秸秆进行处理1～5h，处理后进行固液分离，将得到的固体用水洗涤1～3次、烘干，在20～100℃条件下，用碳酸钠溶液或次氯酸钠溶液浸泡处理，然后烘干得到预处理秸秆；
(2)酶法转化纤维素合成纤维二糖：按质量比1:5～20，将步骤(1)得到的预处理秸秆加入到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，然后在45～55℃条件下，加入40～60u/g纤维素内切酶和40～60u/g纤维素外切酶进行酶解，得到纤维二糖；
(3)酶法转化纤维二糖合成1,6-二磷酸果糖：然后在45～55℃条件下，向步骤(2)的纤维二糖中加入90～110u/g纤维二糖磷酸化酶、40～60u/g葡萄糖磷酸变位酶、40～60u/g磷酸葡萄糖异构酶和40～60u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶进行酶解，得到1,6-二磷酸果糖。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种利用木质纤维素生物质合成高附加值1,6-二磷酸果糖的工艺。采用新型双氢键低共熔溶剂作为预处理试剂以去除生物质中的半纤维素和木质素，提高纤维素可及性，加入纤维素内切酶和外切酶将纤维素转化为纤维二糖，加入纤维二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡萄糖异构酶和焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶合成1,6-二磷酸果糖。本发明利用廉价易得的木质纤维素生物质为出发材料，通过生物转化合成高能磷酸化合物，具有成本低、反应温和、操作简单等特点，有助于缓解秸秆的传统处理方式带来的环境污染问题，具有非常好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
纤维二糖浓度测定采用hplc方法，检测器为示差检测器，色谱柱型号为hi-plexh(300mm×7.7mm)，柱温30℃。纤维二糖得率计算公式如下：
fdp的浓度测定采用hplc方法，检测器为示差检测器，色谱柱型号为hi-plexh(300mm×7.7mm)，柱温30℃。fdp得率计算公式如下：
实施例1：水稻秸秆生物转化合成1,6-二磷酸果糖
(1)双氢键供体低共熔溶剂(氯化胆碱:甲酸:乙酸)预处理水稻秸秆
取100g氯化胆碱:甲酸:乙酸(1:1:1)，加入10g水稻秸秆(低共熔溶剂与水稻秸秆质量比为10:1)，在140℃下搅拌处理2h，然后将混合物离心，用去离子水洗涤沉淀3次。烘干至恒重后，过筛。再用0.5％碳酸钠溶液在80℃下处理1.5h，烘干过筛后即可得到低共熔溶剂和碳酸钠结合处理后的水稻秸秆。
(2)双酶转化纤维素合成纤维二糖
将预处理后的水稻秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，100mm)按10％固液比混合，然后添加50u/g的纤维素内切酶和50u/g的外切酶进行酶解，在50℃和150rpm的水浴摇床上酶解24h，水解纤维素生成纤维二糖。最终纤维二糖的得率为80％。
(3)四酶转化纤维二糖合成
向反应体系中加入100u/g的纤维二糖磷酸化酶、50u/g葡萄糖磷酸变位酶、50u/g磷酸葡萄糖异构酶和50u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶，在50℃和150rpm的水浴摇床上进行四酶一锅生物转化反应。最终，1,6-二磷酸果糖的得率为53％。
实施例2：水稻秸秆生物转化合成1,6-二磷酸果糖
(1)新型低共熔溶剂(乙胺盐酸盐:乳酸)预处理水稻秸秆
取100g乙胺盐酸盐:乳酸(1:1)，加入10g水稻秸秆(低共熔溶剂与水稻秸秆质量比为10:1)，在140℃下搅拌处理2h，然后将混合物离心，用去离子水洗涤沉淀3次。烘干至恒重后，过筛。再用0.5％碳酸钠在80℃下处理1.5h，烘干过筛后即可得到低共熔溶剂和碳酸钠结合处理后的水稻秸秆。
(2)双酶转化纤维素合成纤维二糖
将预处理后的水稻秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，100mm)按10％固液比混合，然后添加50u/g的纤维素内切酶和50u/g的外切酶进行酶解，在50℃和150rpm的水浴摇床上酶解24h，水解纤维素生成纤维二糖。最终纤维二糖的得率为80％。
(3)四酶转化纤维二糖合成
向反应体系中加入100u/g的纤维二糖磷酸化酶、50u/g葡萄糖磷酸变位酶、50u/g磷酸葡萄糖异构酶和50u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶，在50℃和150rpm的水浴摇床上进行四酶一锅生物转化反应。最终，1,6-二磷酸果糖的得率为62％。
实施例3：水稻秸秆生物转化合成1,6-二磷酸果糖
(1)双氢键供体低共熔溶剂(氯化胆碱:甲酸:乙酸)预处理水稻秸秆
取100g氯化胆碱:甲酸:乙酸(1:1:1)，加入5g水稻秸秆(低共熔溶剂与水稻秸秆质量比为20:1)，在120℃下搅拌处理3h，然后将混合物离心，用去离子水洗涤沉淀3次。烘干至恒重后，过筛。再用5％碳酸钠在50℃下处理6h，烘干过筛后即可得到低共熔溶剂和碳酸钠结合处理后的水稻秸秆。
(2)双酶转化纤维素合成纤维二糖
将预处理后的水稻秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，100mm)按5％固液比混合，然后添加50u/g的纤维素内切酶和50u/g的外切酶进行酶解，在50℃和150rpm的水浴摇床上酶解24h，水解纤维素生成纤维二糖。最终纤维二糖的得率为88％。
(3)四酶转化纤维二糖合成
向反应体系中加入100u/g的纤维二糖磷酸化酶、50u/g葡萄糖磷酸变位酶、50u/g磷酸葡萄糖异构酶和50u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶，在50℃和150rpm的水浴摇床上进行四酶一锅生物转化反应。最终，1,6-二磷酸果糖的得率为58％。
实施例4：水稻秸秆生物转化合成1,6-二磷酸果糖
(1)双氢键供体低共熔溶剂(氯化胆碱:甲酸:乙酸)预处理水稻秸秆
取100g氯化胆碱:甲酸:乙酸(1:1:1)，加入20g水稻秸秆(低共熔溶剂与水稻秸秆质量比为5:1)，在140℃下搅拌处理2h，然后将混合物离心，用去离子水洗涤沉淀3次。烘干至恒重后，过筛。再用1％次氯酸钠溶液在80℃下处理1.5h，烘干过筛后即可得到低共熔溶剂和次氯酸钠溶液结合处理后的水稻秸秆。
(2)双酶转化纤维素合成纤维二糖
将预处理后的水稻秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，100mm)按10％固液比混合，然后添加50u/g的纤维素内切酶和50u/g的外切酶进行酶解，在50℃和150rpm的水浴摇床上酶解24h，水解纤维素生成纤维二糖。最终纤维二糖的得率为82％。
(3)四酶转化纤维二糖合成
向反应体系中加入100u/g的纤维二糖磷酸化酶、50u/g葡萄糖磷酸变位酶、50u/g磷酸葡萄糖异构酶和50u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶，在50℃和150rpm的水浴摇床上进行四酶一锅生物转化反应。最终，1,6-二磷酸果糖的得率为53％。
实施例5：玉米秸秆生物转化合成1,6-二磷酸果糖
(1)双氢键供体低共熔溶剂(氯化胆碱:甲酸:乙酸)预处理秸秆
取100g氯化胆碱:甲酸:乙酸(1:1:1)，加入10g玉米秸秆(低共熔溶剂与秸秆质量比为10:1)，在140℃下搅拌处理2h，然后将混合物离心，用去离子水洗涤沉淀3次。烘干至恒重后，过筛。再用0.5％碳酸钠在80℃下处理1.5h，烘干过筛后即可得到低共熔溶剂和碳酸钠结合处理后的秸秆。
(2)双酶转化纤维素合成纤维二糖
将预处理后的秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，100mm)按10％固液比混合，然后添加50u/g的纤维素内切酶和50u/g的外切酶进行酶解，在50℃和150rpm的水浴摇床上酶解24h，水解纤维素生成纤维二糖。最终纤维二糖的得率为90％。
(3)四酶转化纤维二糖合成
向反应体系中加入100u/g的纤维二糖磷酸化酶、50u/g葡萄糖磷酸变位酶、50u/g磷酸葡萄糖异构酶和50u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶，在50℃和150rpm的水浴摇床上进行四酶一锅生物转化反应。最终，1,6-二磷酸果糖的得率为55％。
实施例6：小麦秸秆生物转化合成1,6-二磷酸果糖
(1)双氢键供体低共熔溶剂(氯化胆碱:甲酸:乙酸)预处理秸秆
取100g氯化胆碱:甲酸:乙酸(1:1:1)，加入10g小麦秸秆(低共熔溶剂与小麦秸秆质量比为10:1)，在140℃下搅拌处理2h，然后将混合物离心，用去离子水洗涤沉淀3次。烘干至恒重后，过筛。再用0.5％碳酸钠在80℃下处理1.5h，烘干过筛后即可得到低共熔溶剂和碳酸钠结合处理后的小麦秸秆。
(2)双酶转化纤维素合成纤维二糖
将预处理后的小麦秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph5.0，100mm)按10％固液比混合，然后添加50u/g的纤维素内切酶和50u/g的外切酶进行酶解，在50℃和150rpm的水浴摇床上酶解24h，水解纤维素生成纤维二糖。最终纤维二糖的得率为78％。
(3)四酶转化纤维二糖合成
向反应体系中加入100u/g的纤维二糖磷酸化酶、50u/g葡萄糖磷酸变位酶、50u/g磷酸葡萄糖异构酶和50u/g焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶，在50℃和150rpm的水浴摇床上进行四酶一锅生物转化反应。最终，1,6-二磷酸果糖的得率为51％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。