一种融合蛋白及其应用的制作方法

文档序号：21404177发布日期：2020-07-07 14:37阅读：1097来源：国知局

本发明涉生物医药技术领域，尤其涉及一种融合蛋白及其应用。

背景技术：

磷脂酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinases,pi3k)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶接受来自酪氨酸激酶和g蛋白偶联受体的信号后，在质膜处将底物小分子ptdins(4，5)p2催化形成ptdins(3，4，5)p3(以下简称pi3p)。pi3p激活akt等下游蛋白。该信号通路广泛存在与各种细胞，是细胞内重要的促生存信号通路，调节细胞增殖、分化、生长、存活、代谢和迁移等多种活性。研究表明，pi3k/akt通路异常与人类肿瘤、神经退行性疾病、胰岛素抵抗相关疾病如ii型糖尿病、心脑血管疾病等的发生、发展密切相关。通过对该信号通路的快速、有效以及特异性的开关控制，有助于了解信号的级联传递规律，对于研究与该信号通路密切相关的疾病具有十分重要的意义。

传统方法采用化学物质(如igf-1)激活pi3k/akt通路用于研究正常细胞、肿瘤细胞的迁移和细胞形态变化等，该方法时空分辨率较低，且诱导方法比较复杂。

光遗传学作为一门新兴的学科在以神经科学为主的很多领域被广泛应用，光遗传学技术结合蛋白的遗传学表达与激光的光控和成像，可实现细胞内特定信号通路分子的快速激活与调控。目前已经实现了对pi3k/akt通路的光学调控，如idevall-hagreno等人采用光控工具来控制pi3k在质膜处的产生，见图1。该方法将pi3k的催化亚基p110α利用光控蛋白作用对cibn/cry2将其拉到质膜附近，从而催化pi3p的形成。该方法比传统化学小分子诱导方法简便，时空分辨率较高，但是需要在细胞中需要表达2个融合蛋白，即cibn-caax和mch-cry2-ish2达到最佳效果所需的每种蛋白的表达量需要耗费大量时间精力去摸索，而且ish2是来源于pi3k亚基，过多表达可能对诱导结果产生影响，不利于pi3k/akt通路的控制。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种融合蛋白及其应用。本发明提供的融合蛋白可快速有效、高时空分辨率地局部激活pi3k/akt信号通路。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种融合蛋白，包括质膜定位序列、dab1蛋白、光敏蛋白和荧光蛋白；所述质膜定位序列为lyn蛋白定位序列或kras蛋白定位序列。

在一些实施方案中，所述lyn蛋白定位序列为：

(1)seqidno：1所示的氨基酸序列；

或(2)seqidno：1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得具有同等功能的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述kras蛋白定位序列为：

(1)seqidno：2所示的氨基酸序列；

或(2)seqidno：2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得具有同等功能的氨基酸序列。

在一些具体实施例中，所述光敏蛋白为隐花色素cry2olig蛋白。

在一些具体实施例中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白mcherry或黄色荧光蛋白mcit。

在一些实施方案中，所述融合蛋白具有如seqidno:3～5所示的氨基酸序列或在seqidno:3～5所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的具有同等功能的氨基酸序列。

在一个具体实施例中，所述融合蛋白具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。该融合蛋白由lyn蛋白定位序列、dab1蛋白、隐花色素cry2olig蛋白和红色荧光蛋白mcherry组成，即lyn-dab1-cry2olig-mch。

在一个具体实施例中，所述融合蛋白具有如seqidno:4所示的氨基酸序列。该融合蛋白由lyn蛋白定位序列、dab1蛋白、隐花色素cry2olig蛋白和黄色荧光蛋白mcit组成，即lyn-dab1-cry2olig-mcit。

在一个具体实施例中，所述融合蛋白具有如seqidno:5所示的氨基酸序列。该融合蛋白由dab1蛋白、隐花色素cry2olig蛋白、黄色荧光蛋白mcit和kras蛋白定位序列组成，即dab1-cry2olig-mcit-kras。

本发明还提供了编码本发明所述融合蛋白的dna分子。

在一些实施方案中，本发明提供了编码具有seqidno:3所示的氨基酸序列的dna分子，其核苷酸序列如seqidno.6。

在一些实施方案中，本发明提供了编码具有seqidno:4所示的氨基酸序列的dna分子，其核苷酸序列如seqidno.7。

在一些实施方案中，本发明提供了编码具有seqidno:5所示的氨基酸序列的dna分子，其核苷酸序列如seqidno.8。

由于密码子的简并性，除了seqidno.6～8所示的核苷酸序列，还可以存在很多种能够编码本发明所述的融合蛋白的dna分子。

本发明还提供了一种重组dna载体，包含本发明所述dna分子。

重组dna载体是一种表达载体，本领域技术人员将所述融合蛋白的dna分子克隆到表达载体中，转化宿主细胞，通过诱导表达获得融合蛋白。所述表达载体包括pcag系列载体。在一些实施方案中，所述表达载体为pcag系列中的pcag-dsred2。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含本发明所述重组dna载体。

进一步地，本发明还提供了所述融合蛋白在制备pi3k信号通路激活剂中的应用。所述与pi3k/akt信号通路相关的疾病包括神经退行性疾病、心脑血管疾病和糖尿病

研究表明，本发明提供的融合蛋白可以分别定位于质膜lipidraft(脂筏)/non-lipidraft(非脂筏)区域的lyn-opto-dab1/opto-dab1-kras，可以更加精细的研究性质不同的质膜区域中pi3k激酶活化的效果。经研究发现本发明融合有特定质膜定位序列的lyn-opto-dab1/opto-dab1-kras蛋白，与opto-dab1融合蛋白相比，仅有质膜上的扩散过程，不含胞浆快速扩散的过程，空间分辨率更高。

本发明提供的融合蛋白将lyn的质膜定位序列、dab1蛋白与光敏蛋白及荧光蛋白融合，通过光照可局部地、高时空分辨率地实现pi3k/akt信号通路的快速激活与调控。对该信号通路快速、有效以及特异性的开关控制，有助于了解信号的级联传递规律，对于研究与该信号通路密切相关的疾病具有十分重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为现有技术光控激活pi3k通路的结构示意图；

图2为本发明融合蛋白lyn-dab1-cry2olig-mch结构示意图；

图3为融合蛋白lyn-dab1-cry2olig-mcit与akt-ph-mch共同转染cos7细胞细胞的荧光分析图；

图4为融合蛋白dab1-cry2olig-mcit-kras与akt-ph-mch共同转染cos7细胞细胞的荧光分析图；

图5为融合蛋白lyn-opto-dab1-mch在cos7细胞中的光激活及其引起的细胞形态改变的荧光分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种融合蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1lyn-dab1-cry2olig-mch融合蛋白的制备

利用分子克隆基本技术，将编码lyn蛋白质膜定位序列、dab1蛋白与光敏感蛋白cry2olig及红色荧光蛋白mch(mcherry)的dna序列连接起来，导入表达载体pcag-dsred2中，获得重组表达载体，转化入宿主菌大肠杆菌，诱导表达获得融合蛋白(结构示意图见图2)，具有如seqidno:3所示的氨基酸序列，核苷酸序列如seqidno.6所示。

实施例2lyn-dab1-cry2olig-mcit融合蛋白的制备

利用分子克隆基本技术，将编码lyn蛋白质膜定位序列、dab1蛋白与光敏感蛋白cry2olig及黄色荧光蛋白mcit(mcit)的dna序列连接起来，导入表达载体pcag-dsred2中，获得重组表达载体，转化入宿主菌大肠杆菌，诱导表达获得融合蛋白，具有如seqidno:4所示的氨基酸序列，核苷酸序列如seqidno.7所示。

实施例3dab1-cry2olig-mcit-kras融合蛋白的制备

利用分子克隆基本技术，将编码dab1蛋白、光敏感蛋白cry2olig、黄色荧光蛋白mcit(mcit)和kras蛋白质膜定位序列的dna序列连接起来，导入表达载体pcag-dsred2中，获得重组表达载体，转化入宿主菌大肠杆菌，诱导表达获得融合蛋白，具有如seqidno:5所示的氨基酸序列，核苷酸序列如seqidno.8所示。

实施例4

首先，克隆akt-ph-mch基因片段，将其转入表达载体pcag-dsred2中，获得含akt-ph-mch的真核表达载体。

分别将实施例2含lyn-opto-dab1-mcit的重组表达载体和含akt-ph-mch的表达载体通过lipofectamine2000试剂盒转染培养在玻璃底的培养皿中的cos7细胞(购自atcc公司)，过夜培养后，用不含血清的、不含酚红的培养基(购自gibco公司)饥饿细胞16小时。利用商业化的共聚焦显微镜(比如zeisslsm780共聚焦显微镜)，利用红色荧光(可以561nm激发，580-620nm接收荧光)，找到表达的akt-ph-mch探针的细胞。实验中，用488nm/561nm扫描一块区域，荧光共聚焦成像结果见图3。

采用相同的方法对融合蛋白dab1-cry2olig-mcit-kras进行上述实验，结果见图4。

由图3～4结果可知，随着时间从0s到200s，akt-ph-mch发生向质膜转移的现象，结果表明，lyn-dab1-cry2olig-mcit和dab1-cry2olig-mcit-kras均能成功地激活pi3k通路，并在质膜处产生了大量的pi3p小分子。

随着时间从0s到200s，akt-ph-mch发生向质膜转移的现象，结果表明，pi3k通路被激活，在质膜处产生了大量的pi3p小分子，如图3所示。

实施例5

将实施例1含lyn-opto-dab1-mch的重组表达载体通过lipofectamine2000试剂盒转染培养在玻璃底的培养皿中的cos7细胞(购买自atcc公司)，过夜培养后，用不含血清的、不含酚红的培养基(购自gibco公司)饥饿细胞16小时。利用商业化的共聚焦显微镜(比如zeisslsm780共聚焦显微镜)，利用红色荧光(可以561nm激发，580-620nm接收荧光)，找到表达opto-dab1-mch的细胞。选取细胞边缘一小块区域(比如一个直径为6.6μm的圆形区域)，用0.2％功率(根据需要确定大小)的488nm激发线以每个像素0.79μs停留时间的方式做10次扫描，进行激活，然后利用红色荧光通道及明场通道分别观察细胞荧光和明场下的形态。每5秒成一次像。可见在200s处，圆形区域及附近的细胞膜运动很明显，出现皱褶及向细胞外空间延伸，见图5。

由图5结果可知，用488nm激发光快速扫描白色示意的圆圈区域(即激活区域)，即可观察到激活区域红色信号的增强，随后在明场图中可观察到细胞质膜的变形，结果显示，本发明提供的融合蛋白可局部地、高时空分辨率地实现pi3k/akt信号通路的快速激活，可实现高时空分辨率地观察细胞形态变化。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>深圳先进技术研究院

<120>一种融合蛋白及其应用

<130>mp1829176

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metglycysilelysserlysarglysaspasnleuasnaspaspglu

151015

<210>2

<211>14

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

lyslyslyslyslyslysserlysthrlyscysvalilemet

1510

<210>3

<211>1318

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

metglycysilelysserlysarglysaspasnleuasnaspaspglu

151015

serthrgluthrgluleuglnvalalavallysthrseralalyslys

202530

aspserarglyslysglyglnaspargserglualathrleuilelys

354045

argphelysglygluglyvalargtyrlysalalysleuileglyile

505560

aspgluvalseralaalaargglyasplysleucysglnaspsermet

65707580

metlysleulysglyvalvalalaglyalaargserlysglygluhis

859095

lysglnlysilepheleuthrileserpheglyglyilelysilephe

100105110

aspglulysthrglyalaleuglnhishishisalavalhisgluile

115120125

sertyrilealalysaspilethrasphisargalapheglytyrval

130135140

cysglylysgluglyasnhisargphevalalailelysthralagln

145150155160

alaalagluprovalileleuaspleuargaspleupheglnleuile

165170175

tyrgluleulysglnargglugluleuglulyslysalaglnlysasp

180185190

lysglncysgluglnalavaltyrglnthrileleuglugluaspval

195200205

gluaspprovaltyrglntyrilevalpheglualaglyhisglupro

210215220

ileargaspprogluthrglugluasniletyrglnvalprothrser

225230235240

glnlyslysgluglyvaltyraspvalprolysserglnprovalser

245250255

alavalthrglnleugluleupheglyaspmetserthrproproasp

260265270

ilethrserproprothrproalathrproglyaspalapheleupro

275280285

serserserglnthrleuproglyseralaaspvalpheglysermet

290295300

serpheglythralaalavalproserglytyrvalalametglyala

305310315320

valleuproserphetrpglyglnglnproleuvalglnglnglnile

325330335

alametglyalaglnproprovalalaglnvalileproglyalagln

340345350

proilealatrpglyglnproglyleupheproalathrglnglnala

355360365

trpprothrvalalaglyglnpheproproalaalaphemetprothr

370375380

glnthrvalmetproleualaalaalametpheglnglyproleuthr

385390395400

proleualathrvalproglythrasnaspseralaargserserpro

405410415

glnserasplysproargglnlysmetglylysgluserphelysasp

420425430

pheglnmetvalglnproproprovalproserarglysproaspgln

435440445

proserleuthrcysthrserglualaphesersertyrpheasnlys

450455460

valglyvalalaglnaspthraspaspcysaspasppheaspileser

465470475480

glnleuasnleuthrprovalthrserthrthrproserthrasnser

485490495

proprothrproalaproargglnserserproserlysserserala

500505510

serhisvalseraspprothralaaspaspilepheglugluglyphe

515520525

gluserproserlysserglugluglnglualaproaspglysergln

530535540

alaserserthrserasppropheglygluproserglygluproser

545550555560

glyaspasnileserproglnaspglyserglyserleuglualathr

565570575

metlysmetasplyslysthrilevaltrppheargargaspleuarg

580585590

ilegluaspasnproalaleualaalaalaalahisgluglyserval

595600605

pheprovalpheiletrpcysprogluglugluglyglnphetyrpro

610615620

glyargalaserargtrptrpmetlysglnserleualahisleuser

625630635640

glnserleulysalaleuglyseraspleuthrleuilelysthrhis

645650655

asnthrileseralaileleuaspcysileargvalthrglyalathr

660665670

lysvalvalpheasnhisleutyraspprovalserleuvalargasp

675680685

histhrvallysglulysleuvalgluargglyileservalglnser

690695700

tyrasnglyaspleuleutyrgluprotrpgluiletyrcysglulys

705710715720

glylysprophethrserpheasnsertyrtrplyslyscysleuasp

725730735

metserilegluservalmetleuproproprotrpargleumetpro

740745750

ilethralaalaalaglualailetrpalacysserileglugluleu

755760765

glyleugluasnglualaglulysproserasnalaleuleuthrarg

770775780

alatrpserproglytrpserasnalaasplysleuleuasngluphe

785790795800

ileglulysglnleuileasptyralalysasnserlyslysvalval

805810815

glyasnserthrserleuleuserprotyrleuhispheglygluile

820825830

servalarghisvalpheglncysalaargmetlysglnileiletrp

835840845

alaargasplysasnsergluglyglugluseralaaspleupheleu

850855860

argglyileglyleuargglutyrserargtyrilecyspheasnphe

865870875880

prophethrhisgluglnserleuleuserhisleuargphephepro

885890895

trpaspalaaspvalasplysphelysalatrpargglnglyargthr

900905910

glytyrproleuvalaspalaglymetarggluleutrpalathrgly

915920925

trpmethisasnargileargvalilevalserserphealavallys

930935940

pheleuleuleuprotrplystrpglymetlystyrphetrpaspthr

945950955960

leuleuaspalaaspleuglucysaspileleuglytrpglntyrile

965970975

serglyserileproaspglyhisgluleuaspargleuaspasnpro

980985990

alaleuglnglyalalystyraspprogluglyglutyrilearggln

99510001005

trpleuprogluleualaargleuprothrglutrpilehishispro

101010151020

trpaspalaproleuthrvalleulysalaserglyvalgluleugly

1025103010351040

thrasntyralalysproilevalaspileaspthralaarggluleu

104510501055

leualalysalaileserargthrargglyalaglnilemetilegly

106010651070

alaalaalaargaspproprovalalathrmetvalserlysglyglu

107510801085

gluaspasnmetalaileilelysgluphemetargphelysvalhis

109010951100

metgluglyservalasnglyhisgluphegluilegluglyglugly

1105111011151120

gluglyargprotyrgluglythrglnthralalysleulysvalthr

112511301135

lysglyglyproleuprophealatrpaspileleuserproglnphe

114011451150

mettyrglyserlysalatyrvallyshisproalaaspileproasp

115511601165

tyrleulysleuserpheprogluglyphelystrpgluargvalmet

117011751180

asnphegluaspglyglyvalvalthrvalthrglnaspserserleu

1185119011951200

glnaspglyglupheiletyrlysvallysleuargglythrasnphe

120512101215

proseraspglyprovalmetglnlyslysthrmetglytrpgluala

122012251230

sersergluargmettyrprogluaspglyalaleulysglygluile

123512401245

lysglnargleulysleulysaspglyglyhistyraspalagluval

125012551260

lysthrthrtyrlysalalyslysprovalglnleuproglyalatyr

1265127012751280

asnvalasnilelysleuaspilethrserhisasngluasptyrthr

128512901295

ilevalgluglntyrgluargalagluglyarghisserthrglygly

130013051310

metaspgluleutyrlys

1315

<210>4

<211>1328

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

metglycysilelysserlysarglysaspasnleuasnaspaspglu

151015

serthrgluthrgluleuglnvalalavallysthrseralalyslys

202530

aspserarglyslysglyglnaspargserglualathrleuilelys

354045

argphelysglygluglyvalargtyrlysalalysleuileglyile

505560

aspgluvalseralaalaargglyasplysleucysglnaspsermet

65707580

metlysleulysglyvalvalalaglyalaargserlysglygluhis

859095

lysglnlysilepheleuthrileserpheglyglyilelysilephe

100105110

aspglulysthrglyalaleuglnhishishisalavalhisgluile

115120125

sertyrilealalysaspilethrasphisargalapheglytyrval

130135140

cysglylysgluglyasnhisargphevalalailelysthralagln

145150155160

alaalagluprovalileleuaspleuargaspleupheglnleuile

165170175

tyrgluleulysglnargglugluleuglulyslysalaglnlysasp

180185190

lysglncysgluglnalavaltyrglnthrileleuglugluaspval

195200205

gluaspprovaltyrglntyrilevalpheglualaglyhisglupro

210215220

ileargaspprogluthrglugluasniletyrglnvalprothrser

225230235240

glnlyslysgluglyvaltyraspvalprolysserglnprovalser

245250255

alavalthrglnleugluleupheglyaspmetserthrproproasp

260265270

ilethrserproprothrproalathrproglyaspalapheleupro

275280285

serserserglnthrleuproglyseralaaspvalpheglysermet

290295300

serpheglythralaalavalproserglytyrvalalametglyala

305310315320

valleuproserphetrpglyglnglnproleuvalglnglnglnile

325330335

alametglyalaglnproprovalalaglnvalileproglyalagln

340345350

proilealatrpglyglnproglyleupheproalathrglnglnala

355360365

trpprothrvalalaglyglnpheproproalaalaphemetprothr

370375380

glnthrvalmetproleualaalaalametpheglnglyproleuthr

385390395400

proleualathrvalproglythrasnaspseralaargserserpro

405410415

glnserasplysproargglnlysmetglylysgluserphelysasp

420425430

pheglnmetvalglnproproprovalproserarglysproaspgln

435440445

proserleuthrcysthrserglualaphesersertyrpheasnlys

450455460

valglyvalalaglnaspthraspaspcysaspasppheaspileser

465470475480

glnleuasnleuthrprovalthrserthrthrproserthrasnser

485490495

proprothrproalaproargglnserserproserlysserserala

500505510

serhisvalseraspprothralaaspaspilepheglugluglyphe

515520525

gluserproserlysserglugluglnglualaproaspglysergln

530535540

alaserserthrserasppropheglygluproserglygluproser

545550555560

glyaspasnileserproglnaspglyserglyserleuglualathr

565570575

metlysmetasplyslysthrilevaltrppheargargaspleuarg

580585590

ilegluaspasnproalaleualaalaalaalahisgluglyserval

595600605

pheprovalpheiletrpcysprogluglugluglyglnphetyrpro

610615620

glyargalaserargtrptrpmetlysglnserleualahisleuser

625630635640

glnserleulysalaleuglyseraspleuthrleuilelysthrhis

645650655

asnthrileseralaileleuaspcysileargvalthrglyalathr

660665670

lysvalvalpheasnhisleutyraspprovalserleuvalargasp

675680685

histhrvallysglulysleuvalgluargglyileservalglnser

690695700

tyrasnglyaspleuleutyrgluprotrpgluiletyrcysglulys

705710715720

glylysprophethrserpheasnsertyrtrplyslyscysleuasp

725730735

metserilegluservalmetleuproproprotrpargleumetpro

740745750

ilethralaalaalaglualailetrpalacysserileglugluleu

755760765

glyleugluasnglualaglulysproserasnalaleuleuthrarg

770775780

alatrpserproglytrpserasnalaasplysleuleuasngluphe

785790795800

ileglulysglnleuileasptyralalysasnserlyslysvalval

805810815

glyasnserthrserleuleuserprotyrleuhispheglygluile

820825830

servalarghisvalpheglncysalaargmetlysglnileiletrp

835840845

alaargasplysasnsergluglyglugluseralaaspleupheleu

850855860

argglyileglyleuargglutyrserargtyrilecyspheasnphe

865870875880

prophethrhisgluglnserleuleuserhisleuargphephepro

885890895

trpaspalaaspvalasplysphelysalatrpargglnglyargthr

900905910

glytyrproleuvalaspalaglymetarggluleutrpalathrgly

915920925

trpmethisasnargileargvalilevalserserphealavallys

930935940

pheleuleuleuprotrplystrpglymetlystyrphetrpaspthr

945950955960

leuleuaspalaaspleuglucysaspileleuglytrpglntyrile

965970975

serglyserileproaspglyhisgluleuaspargleuaspasnpro

980985990

alaleuglnglyalalystyraspprogluglyglutyrilearggln

99510001005

trpleuprogluleualaargleuprothrglutrpilehishispro

101010151020

trpaspalaproleuthrvalleulysalaserglyvalgluleugly

1025103010351040

thrasntyralalysproilevalaspileaspthralaarggluleu

104510501055

leualalysalaileserargthrargglyalaglnilemetilegly

106010651070

alaalaalaargaspproprovalalathrmetvalserlysglyglu

107510801085

gluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspglyasp

109010951100

valasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyaspala

1105111011151120

thrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylysleu

112511301135

provalprotrpprothrleuvalthrthrpheglytyrglyleumet

114011451150

cysphealaargtyrproasphismetlysglnhisaspphephelys

115511601165

seralametprogluglytyrvalglngluargthrilephephelys

117011751180

aspaspglyasntyrlysthrargalagluvallysphegluglyasp

1185119011951200

thrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysgluasp

120512101215

glyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhisasn

122012251230

valtyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysvalasnphe

123512401245

lysilearghisasnilegluaspglyservalglnleualaasphis

125012551260

tyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleuproasp

1265127012751280

asnhistyrleusertyrglnserlysleuserlysaspproasnglu

128512901295

lysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalaglyile

130013051310

thrleuglymetaspgluleutyrlysserglyargaspserargser

131513201325

<210>5

<211>1320

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

metserthrgluthrgluleuglnvalalavallysthrseralalys

151015

lysaspserarglyslysglyglnaspargserglualathrleuile

202530

lysargphelysglygluglyvalargtyrlysalalysleuilegly

354045

ileaspgluvalseralaalaargglyasplysleucysglnaspser

505560

metmetlysleulysglyvalvalalaglyalaargserlysglyglu

65707580

hislysglnlysilepheleuthrileserpheglyglyilelysile

859095

pheaspglulysthrglyalaleuglnhishishisalavalhisglu

100105110

ilesertyrilealalysaspilethrasphisargalapheglytyr

115120125

valcysglylysgluglyasnhisargphevalalailelysthrala

130135140

glnalaalagluprovalileleuaspleuargaspleupheglnleu

145150155160

iletyrgluleulysglnargglugluleuglulyslysalaglnlys

165170175

asplysglncysgluglnalavaltyrglnthrileleuglugluasp

180185190

valgluaspprovaltyrglntyrilevalpheglualaglyhisglu

195200205

proileargaspprogluthrglugluasniletyrglnvalprothr

210215220

serglnlyslysgluglyvaltyraspvalprolysserglnproval

225230235240

seralavalthrglnleugluleupheglyaspmetserthrpropro

245250255

aspilethrserproprothrproalathrproglyaspalapheleu

260265270

proserserserglnthrleuproglyseralaaspvalpheglyser

275280285

metserpheglythralaalavalproserglytyrvalalametgly

290295300

alavalleuproserphetrpglyglnglnproleuvalglnglngln

305310315320

ilealametglyalaglnproprovalalaglnvalileproglyala

325330335

glnproilealatrpglyglnproglyleupheproalathrglngln

340345350

alatrpprothrvalalaglyglnpheproproalaalaphemetpro

355360365

thrglnthrvalmetproleualaalaalametpheglnglyproleu

370375380

thrproleualathrvalproglythrasnaspseralaargserser

385390395400

proglnserasplysproargglnlysmetglylysgluserphelys

405410415

asppheglnmetvalglnproproprovalproserarglysproasp

420425430

glnproserleuthrcysthrserglualaphesersertyrpheasn

435440445

lysvalglyvalalaglnaspthraspaspcysaspasppheaspile

450455460

serglnleuasnleuthrprovalthrserthrthrproserthrasn

465470475480

serproprothrproalaproargglnserserproserlysserser

485490495

alaserhisvalseraspprothralaaspaspilephegluglugly

500505510

phegluserproserlysserglugluglnglualaproaspglyser

515520525

glnalaserserthrserasppropheglygluproserglyglupro

530535540

serglyaspasnileserproglnaspglyserglyserleugluala

545550555560

thrmetlysmetasplyslysthrilevaltrppheargargaspleu

565570575

argilegluaspasnproalaleualaalaalaalahisgluglyser

580585590

valpheprovalpheiletrpcysprogluglugluglyglnphetyr

595600605

proglyargalaserargtrptrpmetlysglnserleualahisleu

610615620

serglnserleulysalaleuglyseraspleuthrleuilelysthr

625630635640

hisasnthrileseralaileleuaspcysileargvalthrglyala

645650655

thrlysvalvalpheasnhisleutyraspprovalserleuvalarg

660665670

asphisthrvallysglulysleuvalgluargglyileservalgln

675680685

sertyrasnglyaspleuleutyrgluprotrpgluiletyrcysglu

690695700

lysglylysprophethrserpheasnsertyrtrplyslyscysleu

705710715720

aspmetserilegluservalmetleuproproprotrpargleumet

725730735

proilethralaalaalaglualailetrpalacysserilegluglu

740745750

leuglyleugluasnglualaglulysproserasnalaleuleuthr

755760765

argalatrpserproglytrpserasnalaasplysleuleuasnglu

770775780

pheileglulysglnleuileasptyralalysasnserlyslysval

785790795800

valglyasnserthrserleuleuserprotyrleuhispheglyglu

805810815

ileservalarghisvalpheglncysalaargmetlysglnileile

820825830

trpalaargasplysasnsergluglyglugluseralaaspleuphe

835840845

leuargglyileglyleuargglutyrserargtyrilecyspheasn

850855860

pheprophethrhisgluglnserleuleuserhisleuargphephe

865870875880

protrpaspalaaspvalasplysphelysalatrpargglnglyarg

885890895

thrglytyrproleuvalaspalaglymetarggluleutrpalathr

900905910

glytrpmethisasnargileargvalilevalserserphealaval

915920925

lyspheleuleuleuprotrplystrpglymetlystyrphetrpasp

930935940

thrleuleuaspalaaspleuglucysaspileleuglytrpglntyr

945950955960

ileserglyserileproaspglyhisgluleuaspargleuaspasn

965970975

proalaleuglnglyalalystyraspprogluglyglutyrilearg

980985990

glntrpleuprogluleualaargleuprothrglutrpilehishis

99510001005

protrpaspalaproleuthrvalleulysalaserglyvalgluleu

101010151020

glythrasntyralalysproilevalaspileaspthralaargglu

1025103010351040

leuleualalysalaileserargthrargglyalaglnilemetile

104510501055

glyalaalaalaargaspproprovalalathrmetvalserlysgly

106010651070

glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly

107510801085

aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp

109010951100

alathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylys

1105111011151120

leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrpheglytyrglyleu

112511301135

metcysphealaargtyrproasphismetlysglnhisaspphephe

114011451150

lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrilephephe

115511601165

lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly

117011751180

aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu

1185119011951200

aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis

120512101215

asnvaltyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysvalasn

122012251230

phelysilearghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp

123512401245

histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro

125012551260

aspasnhistyrleusertyrglnserlysleuserlysaspproasn

1265127012751280

glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly

128512901295

ilethrleuglymetaspgluleutyrlyslyslyslyslyslyslys

130013051310

serlysthrlyscysvalilemet

13151320

<210>6

<211>3957

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

atgggatgtattaaatcaaagaggaaggacaacctcaatgacgatgaatcaactgagaca60

gaacttcaagtagctgtgaaaaccagcgccaagaaagactccaggaagaaaggtcaggat120

cgcagcgaagccactttgataaagaggtttaaaggcgaaggggtccggtacaaagccaag180

ctgattgggattgatgaagtgtccgcagctcggggagacaagttatgtcaagattccatg240

atgaagctcaagggtgttgttgctggcgcacgttccaagggagaacacaaacagaaaatc300

tttttaaccatctcctttggaggaatcaaaatctttgatgagaagacgggggcccttcag360

catcaccatgctgttcatgaaatttcctacattgcgaaggacatcacagatcatcgggct420

ttcggatacgtttgcgggaaggaagggaatcacagatttgtggccatcaaaacagcccag480

gcggctgaacctgttatcctggacttgagagatctctttcaactcatctatgagctgaag540

caaagagaagaattggaaaaaaaggcacaaaaggataagcagtgtgaacaagctgtgtac600

cagaccattttggaagaggatgtggaagatcccgtgtaccagtacattgtgtttgaggct660

ggacatgagccaatccgtgatcctgaaacagaagagaacatttaccaggttcccaccagc720

caaaagaaggaaggtgtttatgatgtgccaaaaagtcaacctgtaagtgctgtgacccaa780

ttagaactttttggagacatgtccacccctcctgatataacctctccccctactcctgca840

accccaggtgatgcctttctcccgtcgtcgtcccagacgcttccggggagtgcagatgtg900

tttggctctatgtctttcggcactgctgctgtaccctcaggttatgtcgctatgggcgcc960

gtcctcccatccttctggggccagcagccccttgttcaacagcagatcgccatgggtgct1020

cagccacccgtcgctcaggtgataccaggagctcagcccatcgcatggggccagccaggt1080

ctctttcctgccacccagcaagcctggcccactgtggccgggcagttcccgccagccgcc1140

ttcatgcccacacaaactgttatgcctttagcagccgccatgttccaaggtcccctcacc1200

ccccttgcaaccgtcccaggcacgaatgactctgccaggtcaagtccacagagtgacaag1260

cccaggcagaaaatggggaaggagtctttcaaggatttccagatggtccagcctccaccc1320

gtaccctcccggaagcctgaccagccctccctgacctgtacctcagaggccttctccagt1380

tacttcaacaaagtcggggtggcacaggatacagacgactgtgatgactttgacatctcc1440

caactgaacttgacccctgtgacttctaccacaccatctaccaactcacctccaacccca1500

gcccctaggcagagctctccatccaaatcatcagcatcccacgtcagtgacccgaccgca1560

gatgacatcttcgaagaaggctttgaaagtcccagcaaaagtgaagaacaagaagcacct1620

gatggatcacaggcctcctccaccagtgatccatttggggagcccagtggtgagcccagt1680

ggtgataatataagtccacaagacggtagcggttccctcgaggccaccatgaagatggac1740

aaaaagactatagtttggtttagaagagacctaaggattgaggataatcctgcattagca1800

gcagctgctcacgaaggatctgtttttcctgtcttcatttggtgtcctgaagaagaagga1860

cagttttatcctggaagagcttcaagatggtggatgaaacaatcacttgctcacttatct1920

caatccttgaaggctcttggatctgacctcactttaatcaaaacccacaacacgatttca1980

gcgatcttggattgtatccgcgttaccggtgctacaaaagtcgtctttaaccacctctat2040

gatcctgtttcgttagttcgggaccataccgtaaaggagaagctggtggaacgtgggatc2100

tctgtgcaaagctacaatggagatctattgtatgaaccgtgggagatatactgcgaaaag2160

ggcaaaccttttacgagtttcaattcttactggaagaaatgcttagatatgtcgattgaa2220

tccgttatgcttcctcctccttggcggttgatgccaataactgcagcggctgaagcgatt2280

tgggcgtgttcgattgaagaactagggctggagaatgaggccgagaaaccgagcaatgcg2340

ttgttaactagagcttggtctccaggatggagcaatgctgataagttactaaatgagttc2400

atcgagaagcagttgatagattatgcaaagaacagcaagaaagttgttgggaattctact2460

tcactactttctccgtatctccatttcggggaaataagcgtcagacacgttttccagtgt2520

gcccggatgaaacaaattatatgggcaagagataagaacagtgaaggagaagaaagtgca2580

gatctttttcttaggggaatcggtttaagagagtattctcggtatatatgtttcaacttc2640

ccgtttactcacgagcaatcgttgttgagtcatcttcggtttttcccttgggatgctgat2700

gttgataagttcaaggcctggagacaaggcaggaccggttatccgttggtggatgccgga2760

atgagagagctttgggctaccggatggatgcataacagaataagagtgattgtttcaagc2820

tttgctgtgaagtttcttctccttccatggaaatggggaatgaagtatttctgggataca2880

cttttggatgctgatttggaatgtgacatccttggctggcagtatatctctgggagtatc2940

cccgatggccacgagcttgatcgcttggacaatcccgcgttacaaggcgccaaatatgac3000

ccagaaggtgagtacataaggcaatggcttcccgagcttgcgagattgccaactgaatgg3060

atccatcatccatgggacgctcctttaaccgtactcaaagcttctggtgtggaactcgga3120

acaaactatgcgaaacccattgtagacatcgacacagctcgtgagctactagctaaagct3180

atttcaagaacccgtggagcacagatcatgatcggagcagcagcccgggatccaccggtc3240

gccaccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgc3300

ttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggc3360

gagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggcccc3420

ctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtg3480

aagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgg3540

gagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctg3600

caggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggc3660

cccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgag3720

gacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactac3780

gacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctac3840

aacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacag3900

tacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa3957

<210>7

<211>3987

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7