一种HindIII限制性核酸内切酶的制备方法与流程

本发明属于分子生物学和细胞工程领域，特别涉及限制性核酸内切酶制备。

背景技术：

限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(typei)、第二型(typeii)及第三型(typeiii)。hindiii限制酶就属于第二型限制酶，只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。识别位点是：aagctt，切割后的片段具有黏性末端，是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。常规的制备方法为从细菌中分离提纯出hindiii限制酶周期长不够稳定。

技术实现要素：

为了解决上述现有各种方法的不足，本发明其中一方面开发了hindiii限制性核酸内切酶的制备方法。本发明通过构建hindiii限制性核酸内切酶的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株，然后进行表达纯化获得hindiii限制性核酸内切酶。

本发明相较常规的制备方法，本发明采用的重组蛋白表达制备方法具有制备周期短、纯化过程简便、产量高等特点。使用本方法制备出的hindiii限制酶，其生理活性高且稳定。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，hindiii限制性核酸内切酶的制备方法构建hindiii限制性核酸内切酶的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株，然后进行表达和纯化。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，上述表达步骤如下：

步骤1，将获得的菌种1：100接种到lb培养基中，37℃，250rmp震荡培养到od600＝0.6时，加入1mmiptg诱导表达，并低温诱导表达，离心收菌；

步骤2破菌，菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合，超声破菌，12k转离心30min收集上清。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，所述破菌缓冲液为20mmtris、250mmnacl和10mm咪唑混合溶液ph8.0。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，所述纯化的方法为镍柱纯化。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，所述纯化步骤如下：

步骤3.1第一步平衡：用平衡缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，10mm咪唑)平衡柱子，直至ph达到8.0，紫外检测读数稳定，检测调零后可以上样，所述样品为步骤2收集的上清。

步骤3.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出。

步骤3.3第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

步骤3.4第四步预洗：用预洗缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，50mm咪唑)预洗，收集洗脱组分。

步骤3.5第五步洗脱：用洗脱液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，100mm咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分。

步骤3.6第六步洗柱：用洗柱缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，250mm咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，使用sds-page检测确定所述纯化步骤中分步洗脱收集到的组分哪个为需要的hindiii限制性核酸内切酶。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法，构建hindiii限制性核酸内切酶的原核表达载体的目的基因为hindiiir，所述目的基因序列如seqno.1。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶，构建hindiii限制性核酸由上述任意一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法制得。

本发明的其中一方面提供了一种hindiii限制性核酸内切酶工程菌，该工程菌包含hindiii限制性核酸内切酶的原核表达载体，上述hindiii限制性核酸内切酶的原核表达载体的目的基因为hindiiir，目的基因序列如seqno.1。

附图说明

图1、为本发明其一个实施例中电泳图；

图2、为本发明另一个实施例中电泳图。

具体实施方式

下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：hindiii限制性核酸内切酶的制备

构建hindiii限制性核酸内切酶的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株：

1.通过基因合成将目的基因hindiiir(seqno.1:5’-atgaagaaaagtgcgttagagaaattattatcactgatagaaaatttaactaatcaagaatttaaacaggcaactaatagtttaatctcatttatttataaattgaatagaaatgaggttattgaattggttagatctattggaatacttcctgaggcaataaaaccaagttctacacaagagaaattattctcaaaagcaggagatattgtattagctaaagcttttcaattacttaatctgaactcaaaaccattagaacagagaggtaatgctggagatgtgatagcactctctaaagaatttaattacggcttagttgctgatgctaaatcttttcgacttagtcgtactgctaaaaatcaaaaagattttaaagtaaaagcgttaagtgaatggcgagaagataaggattatgcagtattaacagcaccattttttcaatatcctacaactaaaagtcaaatttttaagcaatcgttagatgaaaatgttttgttatttagttgggaacatttagctatattattacagttagatttagaggaaactaatattttttcttttgagcaattatggaactttcccaaaaagcaaagtaaaaaaacatctgtatctgatgctgaaaataattttatgagagattttaataaatactttatggatttatttaaaatagataaagatactttaaatcaacttcttcaaaaagagatcaattttattgaagaaagatccttgatagaaaaggaatattggaaaaaacaaataaatattataaaaaattttacaagagaagaagccatagaagcattattgaaagatataaatatgtcttcaaaaatagaaactattgatagttttattaaagggataaaaagtaatgatagactgtatttataa-3’)构建到商业化表达载体pet28a(+)中，获得重组质粒pet28a(+)-hindiiir。

2.通过热激转化法将重组质粒转入bl21(de3)菌株中。

3.加入500ul灭过菌的无抗培养基于37℃摇床250rmp培养1h，使抗性基因表达，菌体复苏。

4.培养后，取30ul培养液加200ul无抗lb，混匀涂带有抗生素的固体培养基平板，随后将平板倒置放于37℃培养箱培养12h以上。

5.在表达菌株平板上挑4个单克隆，置于含3ml带抗性lb培养基试管中，37℃摇床培养3h-4h。

6.培养至od＝0.5左右的时候，每管试管中取出700ul菌液+300ul80％甘油保存菌种。

获得表达菌株后进行表达纯化：

7.将获得的菌种1：100接种到lb培养基中，37℃，250rmp震荡培养到od600＝0.6时，加入1mmiptg诱导表达，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收菌。

8.破菌∶菌体总量与破菌缓冲液(20mmtris,250mmnacl,10mm咪唑,ph8.0)1∶10混合，即1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌。12k转离心30min收集上清，过ni柱纯化。

9.ni柱纯化：

9.1第一步平衡：用平衡缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，10mm咪唑)平衡柱子，缓冲液及样品中不可有edta，arg等物质，直至ph达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5～10个柱体积，检测调零后可以上样。

9.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出。

9.3第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

9.4第四步预洗：用预洗缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，50mm咪唑)预洗，收集洗脱组分。

9.5第五步洗脱：用洗脱液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，100mm咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分。

9.6第六步洗柱：用洗柱缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，250mm咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。

9.7第七步洗柱：用洗柱缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，250mmnacl，500mm咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。

10.分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。依据sds-page检测结果确定第六步洗脱收集到的组分为最终所需要的样品。

最后得到我们所需的hindiii限制性核酸内切酶(如图1所示)：

图1中泳道mk：molecularweightmarker；泳道1：finalproduct(3μg,reduced)；泳道2：finalproduct(3μg,non-reduced)。

酶储存溶液：10mmtris-hcl，300mmnacl，0.1mmedta，1mmdtt，0.5mg/mlbsa，50％glycerol，ph7.4。

10×hindiiibuffer：50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，100μg/mlbsa，ph7.9。

实施例2：hindiii限制性核酸内切酶的活性检测

20μl酶切体系中，以5u/μlhindiii进行5倍梯度稀释，对λdna进行酶切。酶切反应后的电泳图如图2所示：

其中反应体系如下：

37℃，反应1h

75℃，20min，失活

结果如图2所示：泳道1：0.12u；泳道2：0.6u；泳道3：3u；泳道4：15u；泳道m：dnaladder200。

上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

序列表

<110>吴江近岸蛋白质科技有限公司

<120>一种hindiii限制性核酸内切酶的制备方法

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>903

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>

<223>人工设计

<400>1

atgaagaaaagtgcgttagagaaattattatcactgatagaaaatttaactaatcaagaa60

tttaaacaggcaactaatagtttaatctcatttatttataaattgaatagaaatgaggtt120

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