猪支原体肺炎和猪圆环病毒二联基因工程疫苗制备方法与流程

本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型二联基因工程疫苗制备方法及其应用。

背景技术：

猪肺炎支原体(mycoplasmahyopneumonia,mhp)是一种慢性呼吸道传染病的病原体，能引发猪支原体肺炎(mycoplasmalpneumoniaeofswine,mps)，又称“猪气喘病”或“猪地方性肺炎(porcineenzooticpneumonia,pep)”，而该病又具有高感染率和高传染性，给世界养猪业带来巨大的经济损失。猪肺炎支原体常会与猪圆环病毒(pcv)等病原体协同感染，增加了疾病的严重性和潜在的持久性，使呼吸道疾病加重，导致病猪死亡率上升。研究表明，mhp与猪呼吸道上皮细胞纤毛的特异性黏附是引起猪支原体肺炎的关键。在mhp细胞膜上的黏附因子抗原能够引发针对支原体的免疫效应，现已发现p97、p46和p42是三种起重要黏附功能的膜蛋白。

猪圆环病毒2型（pcv2）是能引发猪圆环病毒2型感染系列疾病的一种病原体。感染后猪群免疫力下降，且可并发或继发其他细菌或病毒感染。pcv2可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡。研究表明，猪圆环病毒2型orf2编码病毒的核衣壳蛋白（cap）是其主要的免疫原，能诱导中和抗体的产生，对猪圆环病毒的诊断和疫苗研究有重要的意义，也是研制基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。

杆状病毒（baculovirus）属于昆虫病毒，作为一种高效基因表达载体被广泛用于外源基因的表达研究。该表达系统能够生产具有翻译后修饰的蛋白产物，接近于天然的蛋白结构和生物学活性。杆状病毒载体除具备病毒载体的优势外，还具备安全、制备简单和易于得到高滴度的病毒粒子等优点。gp64蛋白作为目前杆状病毒展示系统中广泛使用的外源基因的融合对象，是杆状病毒的主要囊膜糖蛋白，能介导病毒与被感染细胞的融合。该蛋白主要由氨基端20个氨基酸残基构成的信号肽序列(sp)、中间成熟序列和羧基端gp64跨膜结构域(tmd)3部分构成，其中spgp64负责将胞内表达的gp64引导至细胞膜，tmdgp64负责将与其接触的病毒核衣壳包裹上含有gp64蛋白的细胞膜。随着杆状病毒表面展示技术的发展，外源蛋白往往被融合于spgp64与某跨膜结构域之间，以实现外源蛋白在重组杆状病毒表面的高效展示。

为了研究能同时预防猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型的二联基因工程疫苗产品，本发明通过杆状病毒表达系统共表达了mhp的p97r1、p46和p42的嵌合蛋白和pcv2的cap蛋白，鉴定正确的重组杆状病毒免疫balb/c小鼠和仔猪，经抗体水平和/或淋巴细胞增殖实验等检测证明构建的重组杆状病毒疫苗免疫效果良好，故该方法可作为一种制备mhp和pcv2的二联基因工程疫苗的方法使用。

技术实现要素：

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种核酸，其基因序列如seqidno.1所示，或者其基因序列如seqidno.2所示；或者同时含有如seqidno.1所示的核酸和如seqidno.2所示的核酸。

一种重组表达载体，其特征在于，含有如seqidno.1所示的基因；或含有如seqidno.2所示的基因；或同时含有如seqidno.1所示的基因和如seqidno.2所示的基因；优先地，所述基因导入的载体为pfastbacdual。

一种重组杆状病毒，其特征在于，表达有氨基酸序列如seqidno.3所示，或者氨基酸序列如seqidno.4所示；或者同时含有氨基酸序列如seqidno.3所示的重组蛋白和如seqidno.4所示的重组蛋白。

一种猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型二联基因工程疫苗，其特征在于，所述重组杆状病毒疫苗同时包含有上述的重组蛋白。上述的疫苗还包括疫苗佐剂、助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂中的一种或几种。

其中一些实施例，所述疫苗还包含疫苗佐剂，如兽医学可接受的水性佐剂或油性佐剂。优选的，水性佐剂包括但不限于铝盐系列佐剂、montanideims系列佐剂或montanidegel系列佐剂、蜂胶、免疫刺激复合物、细胞因子类佐剂、核酸及其衍生物类佐剂、卵磷脂类佐剂。所述montanideims系列佐剂包括1313vg、251cvg、2215vg；所述montanidegel系列佐剂为gel01pr或montanidepetgela；所述水包油性系列佐剂包括mf59、montanideisa15avg等；所述细胞因子类佐剂包括白介素(il-1、il-2、il-4、il-12)，干扰素(ifn-γ、ifn-α、ifn-β)等；所述核酸及其衍生物类佐剂包括免疫刺激序列dna(cpgdna)或cpg寡聚脱氧核苷酸等。进一步优选的，水性佐剂优选方式涉及为ims1313nvg、ims2215vg、gel01、卡波姆、氢氧化铝胶的一种或几种的组合物。其中一些实施例，所述疫苗包含弗式完全佐剂和/或弗式不完全佐剂。

其中一些实施例，所述佐剂的浓度范围是从5~50％v/v，优选20~30％v/v，进一步优选25%v/v。

其中一些实施例，所述油性佐剂包括但不限于白油、角鲨烷或角鲨烯、德雷克油(drakeoil)，以及其他动物油、植物油或矿物油。上述油性佐剂既可以是天然来源，也可以是经过人工合成获得的。

其中一些实施例，所述疫苗还包括助悬剂、表面活性剂、抗原灭活剂或防腐剂。所述助悬剂可包括，例如，硬脂酸铝，以及所属技术领域可用的其他助悬剂。所述表面活性剂可包括，例如，脱水山梨醇单油酸酯(twee系列)，司盘(span)，以及所属技术领域可用的其他表面活性剂。所述抗原灭活剂包括但不限于，例如福尔马林、β-丙内酯等等。所述防腐剂包括，例如硫柳汞。上述物质的使用方法及用量均为本领域技术人员所熟知。

本发明还提供重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

构建含有上述核酸的表达载体；

重组杆状病毒的扩增、纯化与检测。

本发明还提供上述核酸、重组载体、重组杆状病毒、疫苗在预防、治疗、诊断猪支原体肺炎和/或猪圆环病毒2型疾病中的应用。

本发明具有以下有益的效果：

(1)所述二联疫苗中多免疫原性蛋白片段的组合可诱导产生协同的免疫效果；

(2)所述二联疫苗免疫小鼠和仔猪后，能产生等同于或类似于分别单独使用商业疫苗所表现出的体液和/或细胞免疫效应，表明此重组病毒疫苗免疫后能引发小鼠和仔猪体内产生特异性的免疫效应。

附图说明

图1是pfastbacdual-p97r1p46p42-cap重组载体构建示意图。

图2是重组蛋白的westernblot鉴定。

图3是重组杆状病毒的电镜照片图。

图4是重组杆状病毒免疫小鼠后血清elisa检测结果。

图5是重组杆状病毒免疫小鼠后脾淋巴细胞增殖指数检测结果。

图6是重组杆状病毒免疫仔猪后血清elisa检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明所述技术方案中，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均购自商业渠道。

本发明所述技术方案提及的一些试剂配方：

pbs：8gnacl，0.2gkcl，1.44gna2hpo4，0.24gkh2po4溶于ddh2o定容至1l；

抗原包被缓冲液：1.59gna2co3，2.93gnahco3，ddh2o定容至1l；

elisa洗涤液：0.05%tween-20的pbs溶液；

elisa封闭液：5%脱脂奶粉，5%bsa的pbs溶液；

elisa抗体稀释液：2%脱脂奶粉，1%bsa的pbs溶液；

elisa终止液：2mh2so4。

实施例1

目的基因的获取及表达载体的构建

在ncbi数据库中查找山东株pcv2cap基因序列（登录号：ky656098.1），删除核定位信号肽，对剩余579bp的核酸序列进行杆状病毒表达系统密码子优化。同样的方法查找mhp168株（登录号：cp002274.1）的p97r1（mhp168_110）、p46（mhp168_522）和p42（mhp168_069）基因序列，对其进行杆状病毒表达系统密码子优化。根据载体和基因的序列选择适当的酶切位点和连接肽序列，人工合成如下融合基因：①xhoⅰ-sp-cap-tmd-6×his-taa-kpnⅰ，其中taa为终止密码子；②bamhⅰ-sp-p97r1-p46-p42-tmd-6×his-taa-hindⅲ，其中p97r1、p46、和p42间均用柔性接头ggsg相连，taa为终止密码子。①和②两条序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。

依次用xhoⅰ和kpnⅰ，bamhⅰ和hindⅲ两组限制性核酸内切酶分别将序列①和②酶切，利用分子生物学方法连入pfastbacdual载体。得到pfastbacdual-p97r1p46p42-cap重组载体，载体图谱如图1所示。

实施例2

重组杆粒的制备、真核表达的检测与病毒的收集

将上述获得的重组质粒pfastbacdual-p97r1p46p42-cap和pfastbacdual空载质粒分别转化入通过cacl2法制备的dh10bac感受态细胞中，经过蓝白斑筛选出阳性克隆。提取阳性杆状病毒质粒，通过fugene6（promega公司）试剂分别转染入密度约为2×10⁶的sf9细胞中，96h后用无菌pbs溶液吹打细胞，离心收集细胞沉淀，提取总蛋白，分别以anti-p97r1，anti-p46，anti-p42，anti-cap和anti-6×his为一抗，通过westernblot方法检测重组蛋白的表达情况，结果如图2所示；收集细胞培养上清，即为p1代重组病毒，分别命名为rvac-p97r1p46p42-cap和rvac-dual。

实施例3

重组杆状病毒的扩增、纯化与检测

按照moi=0.1将p1代重组病毒接种sf9细胞中进行病毒扩增，连续扩增两代后得到病毒毒力相对稳定的p3代重组病毒。将p3代病毒以moi=0.1剂量接种摇瓶培养的悬浮sf9细胞，接种后96h通过低速离心收集病毒上清。35000rpm，4℃超速离心2h，收集沉淀；将沉淀用pbs重悬后缓慢加到事先铺好密度梯度的蔗糖溶液（60-40-20%（w/v））上层，30000rpm，4℃超速离心2h，收集40-60%蔗糖液面间的乳白色浑浊带；将收集的液体用pbs重悬后，35000rpm，4℃超速离心2h去除蔗糖溶液，再次用pbs重悬收集重组杆状病毒。将病毒液负载到200目铜网上，磷钨酸染色后在电镜下观察形态，如图3所示。

实施例4

动物免疫实验

1、小鼠免疫实验

将30只6-8周龄的雌性balb/c小鼠随机分成以下五组：①pbs组；②rvac-dual组；③mhp阳性疫苗组（瑞倍适-旺）④pcv2阳性疫苗组（圆净诺）⑤rvac-p97r1p46p42-cap病毒疫苗组，每组6只。采用皮下注射途径，分别在第0、14和28d进行免疫。其中pbs组每只小鼠注射pbs200μl，阳性疫苗组每只小鼠分别免疫100μl相应商品化疫苗，病毒组每只小鼠分别免疫1×10⁸pfu重组病毒rvac-dual和rvac-p97r1p46p42-cap。分别在第14和28d进行尾部取血，在第35和42d分别对每组3只小鼠进行内眦取血与脾淋巴细胞增殖实验。

具体检测步骤如下：

（1）抗体水平检测：为了评估小鼠对于各种抗原刺激所产生的体液免疫效应，采用间接elisa法，分别用经缓冲液稀释后浓度为1μg/ml抗原rp97、rp46、rp42和cap蛋白包被，elisa封闭液封闭，分别孵育以上14、28、35和42d四个时间段采集的血清（抗体稀释液1:100稀释），再孵育二抗，加显色液显色，其中每两步间均用elisa洗涤液洗板4次，每次1min。最后加入elisa终止液终止显色反应，检测450nm波长下的od值。结果如图4所示，其中**表示p<0.01，***表示p<0.001。重组病毒免疫组的小鼠血清针对四种抗原均能表现出显著的特异性igg反应，且对于rp42蛋白的反应极其显著，表明重组病毒疫苗免疫小鼠后在其体内具有良好的免疫性能。

（2）脾淋巴细胞增殖实验：为了评估小鼠对于各种抗原所产生的细胞免疫效应，使用小鼠淋巴细胞分离液（北京达科为生物技术有限公司）分离35d和42d的小鼠脾淋巴细胞，具体操作流程见产品说明书。计数分离后的各组脾淋巴细胞，96孔板每孔加入100μl稀释至4释至1×10⁶cell/ml。待细胞贴壁后，分别在每孔加入100μl稀释后的混合抗原（rp97，rp46，rp42与cap的混合物，其中四种抗原终浓度均为10μg/ml），1640培养基与阳性对照（刀豆蛋白，终浓度10μg/ml）。将细胞放入co2培养箱培养42h后每孔加入20μgmtt（5mg/ml），继续培养4h，弃尽细胞培养上清液，每孔加入100μldmso溶液，振荡器上震荡混匀5min，最后检测490nm波长下的od值，计算刺激指数（si=刺激孔od值/未刺激孔od值）。结果如图5所示，其中ns表示无显著性差异，***表示p<0.01。病毒疫苗组的小鼠相比较于其他对照组，对于相应抗原刺激能表现出较高的刺激指数，表明此病毒疫苗免疫后能引发小鼠体内产生特异性的细胞免疫效应。

2、仔猪免疫实验

将9只4-5周龄仔猪随机分成以下三组：①rvac-dual空载病毒免疫组，②阳性疫苗免疫组（瑞倍适-旺+圆柯欣）rvac-p97r1p46p42-cap病毒疫苗免疫组，每组3只。采用腿部肌肉注射，分别在第0d和第14d进行免疫。其中阳性疫苗组每只仔猪注射商品化疫苗瑞倍适-旺和圆柯欣各1ml，空载病毒免疫组每只仔猪分别免疫1×10⁹pfu重组病毒rvac-dual，病毒疫苗免疫组每只仔猪分别免疫1×10⁹pfu重组病毒rvac-p97r1p46p42-cap。分别在第0、和28d进行静脉取血，分离血清。同样用rp97、rp46、rp42和cap四种蛋白包被进行间接法elisa检测血清的抗体水平。结果如图6所示，其中***表示p<0.001。重组病毒rvac-p97r1p46p42-cap疫苗免疫组的仔猪血清针对猪肺炎支原体的p97r1、p46、p42及猪圆环病毒2型cap四种抗原均能表现出显著的类似于阳性疫苗免疫后的特异性igg反应（p<0.001），表明重组病毒rvac-p97r1p46p42-cap疫苗在本体动物仔猪上也具有良好的免疫性能。

综上所述，经杆状病毒表达系统制备的的重组病毒rvac-p97r1p46p42-cap免疫小鼠和仔猪后均能起到较好的免疫效果，证明通过此方法制备的重组杆状病毒可以作为研制猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型二联基因工程疫苗的一种方法。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>杭州洪晟生物技术股份有限公司

浙江理工大学

杭州洪桥中科基因技术有限公司

<120>猪支原体肺炎和猪圆环病毒二联基因工程疫苗制备方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>882

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<400>4

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