用于检测H5、H7和H9以及9个NA亚型AIV的引物组合及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测h5、h7和h9以及9个na亚型aiv的引物组合及其应用。

背景技术：

禽流感病毒(aiv)属于正粘病毒科a型流感，根据ha和na抗原性不同，目前，已在禽类发现16个ha亚型和9个na亚型，近年，在蝙蝠发现第17、18个ha亚型和10、11个na亚型。1997年香港出现人类感染h5n1亚型aiv死亡病例，并爆发疫情，使人“谈禽色变”，给养殖业造成严重的经济损失。近年来，aiv感染人的病例陆续有报道，2013年，在我国长三角地区发现h7n9感染人并致死的案例，并在全国大部分地区扩散开来，已引起5波的感染，目前，仍有h7n9感染人的报道，给公共卫生安全造成严重的威胁。h9n2是aiv分离中常见的亚型，为近年感染人的h7n9、h10n8提供基因片段。

gexp系统(geneexpressionprofilergeneticanalysissystem)多重pcr扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引发多重体系扩增。pcr反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cdna的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cdna为模板启动pcr反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，pcr产物经gexp毛细管电泳分离，含有荧光标记的pcr产物经gexp检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段(dnasizestandard,dss)迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。

传统检测h5、h7和h9亚型aiv及其na亚型aiv的方法主要是病毒分离培养，经血凝试验和血凝抑制试验确定ha亚型，再将na基因克隆至载体测序确定na亚型，但耗时长并需要特定的阳性血清。如果能够利用gexp多重基因表达遗传分析系统，建立一种能够同时检测多种h亚型和n亚型禽流感病毒的方法及其配套试剂盒，对于aiv的有效防控将具有重要意义。想建立上述方法，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。但是，基于本领域技术人员的公知常识，设计可以在同一体系中对多个靶片段进行有效扩增的多重pcr的引物组合是非常困难的。目前，还没有基于gexp系统的同时可检测h5、h7、h9、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9亚型aiv的试剂或试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测h5、h7和h9以及9个na亚型aiv的引物组合及其应用。

本发明保护一种引物组合，包括如下13个引物对：

引物对aiv-m由正向引物和反向引物组成，正向引物为(a1)、(a2)、(a3)或(a4)，反向引物为(b1)、(b2)、(b3)或(b4)；

(a1)序列表的序列1所示；

(a2)序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；

(a3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(a4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(a3)和/或(a4)中，基因特异性引物如序列表的序列1第19至38位核苷酸所示；

(b1)序列表的序列2所示；

(b2)序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；

(b3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(b4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(b3)和/或(b4)中，基因特异性引物如序列表的序列2第20至39位核苷酸所示；

引物对h5由正向引物和反向引物组成，正向引物为(c1)、(c2)、(c3)或(c4)，反向引物为(d1)、(d2)、(d3)或(d4)；

(c1)序列表的序列3所示；

(c2)序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；

(c3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(c4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(c3)和/或(c4)中，基因特异性引物如序列表的序列3第19至38位核苷酸所示；

(d1)序列表的序列4所示；

(d2)序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；

(d3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(d4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(d3)和/或(d4)中，基因特异性引物如序列表的序列4第20至39位核苷酸所示；

引物对h7由正向引物和反向引物组成，正向引物为(e1)、(e2)、(e3)或(e4)，反向引物为(f1)、(f2)、(f3)或(f4)；

(e1)序列表的序列5所示；

(e2)序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；

(e3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(e4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(e3)和/或(e4)中，基因特异性引物如序列表的序列5第19至41位核苷酸所示；

(f1)序列表的序列6所示；

(f2)序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；

(f3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(f4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(f3)和/或(f4)中，基因特异性引物如序列表的序列6第20至39位核苷酸所示；

引物对h9由正向引物和反向引物组成，正向引物为(g1)、(g2)、(g3)或(g4)，反向引物为(h1)、(h2)、(h3)或(h4)；

(g1)序列表的序列7所示；

(g2)序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；

(g3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(g4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(g3)和/或(g4)中，基因特异性引物如序列表的序列7第19至37位核苷酸所示；

(h1)序列表的序列8所示；

(h2)序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；

(h3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(h4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(h3)和/或(h4)中，基因特异性引物如序列表的序列8第20至38位核苷酸所示；

引物对n1由正向引物和反向引物组成，正向引物为(i1)、(i2)、(i3)或(i4)，反向引物为(j1)、(j2)、(j3)或(j4)；

(i1)序列表的序列9所示；

(i2)序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；

(i3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(i4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(i3)和/或(i4)中，基因特异性引物如序列表的序列9第19至38位核苷酸所示；

(j1)序列表的序列10所示；

(j2)序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；

(j3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(j4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(j3)和/或(j4)中，基因特异性引物如序列表的序列10第20至38位核苷酸所示；

引物对n2由正向引物和反向引物组成，正向引物为(k1)、(k2)、(k3)或(k4)，反向引物为(l1)、(l2)、(l3)或(l4)；

(k1)序列表的序列11所示；

(k2)序列表的序列11第19至35位核苷酸所示；

(k3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(k4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(k3)和/或(k4)中，基因特异性引物如序列表的序列11第19至35位核苷酸所示；

(l1)序列表的序列12所示；

(l2)序列表的序列12第20至36位核苷酸所示；

(l3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(l4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(l3)和/或(l4)中，基因特异性引物如序列表的序列12第20至36位核苷酸所示；

引物对n3由正向引物和反向引物组成，正向引物为(m1)、(m2)、(m3)或(m4)，反向引物为(n1)、(n2)、(n3)或(n4)；

(m1)序列表的序列13所示；

(m2)序列表的序列13第19至41位核苷酸所示；

(m3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(m4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(m3)和/或(m4)中，基因特异性引物如序列表的序列13第19至41位核苷酸所示；

(n1)序列表的序列14所示；

(n2)序列表的序列14第20至41位核苷酸所示；

(n3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(n4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(n3)和/或(n4)中，基因特异性引物如序列表的序列14第20至41位核苷酸所示；

引物对n4由正向引物和反向引物组成，正向引物为(o1)、(o2)、(o3)或(o4)，反向引物为(p1)、(p2)、(p3)或(p4)；

(o1)序列表的序列15所示；

(o2)序列表的序列15第19至40位核苷酸所示；

(o3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(o4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(o3)和/或(o4)中，基因特异性引物如序列表的序列15第19至40位核苷酸所示；

(p1)序列表的序列16所示；

(p2)序列表的序列16第20至39位核苷酸所示；

(p3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(p4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(p3)和/或(p4)中，基因特异性引物如序列表的序列16第20至39位核苷酸所示；

引物对n5由正向引物和反向引物组成，正向引物为(q1)、(q2)、(q3)或(q4)，反向引物为(r1)、(r2)、(r3)或(r4)；

(q1)序列表的序列17所示；

(q2)序列表的序列17第19至38位核苷酸所示；

(q3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(q4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(q3)和/或(q4)中，基因特异性引物如序列表的序列17第19至38位核苷酸所示；

(r1)序列表的序列18所示；

(r2)序列表的序列18第20至40位核苷酸所示；

(r3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(r4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(r3)和/或(r4)中，基因特异性引物如序列表的序列18第20至40位核苷酸所示；

引物对n6由正向引物和反向引物组成，正向引物为(s1)、(s2)、(s3)或(s4)，反向引物为(t1)、(t2)、(t3)或(t4)；

(s1)序列表的序列19所示；

(s2)序列表的序列19第19至43位核苷酸所示；

(s3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(s4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(s3)和/或(s4)中，基因特异性引物如序列表的序列19第19至43位核苷酸所示；

(t1)序列表的序列20所示；

(t2)序列表的序列20第20至44位核苷酸所示；

(t3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(t4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(t3)和/或(t4)中，基因特异性引物如序列表的序列20第20至44位核苷酸所示；

引物对n7由正向引物和反向引物组成，正向引物为(u1)、(u2)、(u3)或(u4)，反向引物为(v1)、(v2)、(v3)或(v4)；

(u1)序列表的序列21所示；

(u2)序列表的序列21第19至38位核苷酸所示；

(u3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(u4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(u3)和/或(u4)中，基因特异性引物如序列表的序列21第19至38位核苷酸所示；

(v1)序列表的序列22所示；

(v2)序列表的序列22第20至39位核苷酸所示；

(v3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(v4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(v3)和/或(v4)中，基因特异性引物如序列表的序列22第20至39位核苷酸所示；

引物对n8由正向引物和反向引物组成，正向引物为(w1)、(w2)、(w3)或(w4)，反向引物为(x1)、(x2)、(x3)或(x4)；

(w1)序列表的序列23所示；

(w2)序列表的序列23第19至38位核苷酸所示；

(w3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(w4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(w3)和/或(w4)中，基因特异性引物如序列表的序列23第19至38位核苷酸所示；

(x1)序列表的序列24所示；

(x2)序列表的序列24第20至40位核苷酸所示；

(x3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(x4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(x3)和/或(x4)中，基因特异性引物如序列表的序列24第20至40位核苷酸所示；

引物对n9由正向引物和反向引物组成，正向引物为(y1)、(y2)、(y3)或(y4)，反向引物为(z1)、(z2)、(z3)或(z4)；

(y1)序列表的序列25所示；

(y2)序列表的序列25第19至39位核苷酸所示；

(y3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(y4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(y3)和/或(y4)中，基因特异性引物如序列表的序列25第19至39位核苷酸所示；

(z1)序列表的序列26所示；

(z2)序列表的序列26第20至39位核苷酸所示；

(z3)自上游至下游依次包括如下区段：gexp通用引物和基因特异性引物；

(z4)自上游至下游依次由如下区段组成：gexp通用引物和基因特异性引物；

(z3)和/或(z4)中，基因特异性引物如序列表的序列26第20至39位核苷酸所示。

所述引物组合中，各种引物的摩尔量均相等。

所述引物组合由所述13个引物对组成。

本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)、(ⅳ)、(ⅴ)、(ⅵ)、(ⅶ)或(ⅷ)：

(ⅰ)鉴定待测禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅱ)鉴定待测病毒是否为禽流感病毒，如果是禽流感病毒其所属的h亚型和n亚型；

(ⅲ)鉴定待测样本含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅳ)鉴定待测样本是否含有禽流感病毒，如果含有禽流感病毒其所含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅴ)制备试剂盒；所述试剂盒的功能为鉴定待测禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅵ)制备试剂盒；所述试剂盒的功能为鉴定待测病毒是否为禽流感病毒，如果是禽流感病毒其所属的h亚型和n亚型；

(ⅶ)制备试剂盒；所述试剂盒的功能为鉴定待测样本含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅷ)制备试剂盒；所述试剂盒的功能为鉴定待测样本是否含有禽流感病毒，如果含有禽流感病毒其所含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型。

所述应用中：所述h亚型为h5亚型、h7亚型或h9亚型；所述n亚型为n1亚型、n2亚型、n3亚型、n4亚型、n5亚型、n6亚型、n7亚型、n8亚型或n9亚型。

本发明还保护一种试剂盒，含有所述引物组合；所述试剂盒的功能为如下(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅳ)：

(ⅰ)鉴定待测禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅱ)鉴定待测病毒是否为禽流感病毒，如果是禽流感病毒其所属的h亚型和n亚型；

(ⅲ)鉴定待测样本含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型；

(ⅳ)鉴定待测样本是否含有禽流感病毒，如果含有禽流感病毒其所含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型。

所述试剂盒中：所述h亚型为h5亚型、h7亚型或h9亚型；所述n亚型为n1亚型、n2亚型、n3亚型、n4亚型、n5亚型、n6亚型、n7亚型、n8亚型或n9亚型。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所有引物混合包装的步骤。

本发明还保护一种方法，包括如下步骤：

以待测病毒的cdna为模板，采用所述引物组合进行gexp多重pcr，然后采用gexpsystem进行检测分析；

如果显示163bp±3bp范围内的峰，待测病毒为禽流感病毒；

如果显示229bp±3bp范围内的峰，待测病毒为h5亚型禽流感病毒；

如果显示144bp±3bp范围内的峰，待测病毒为h7亚型禽流感病毒；

如果显示332bp±3bp范围内的峰，待测病毒为h9亚型禽流感病毒；

如果显示249bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n1亚型禽流感病毒；

如果显示285bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n2亚型禽流感病毒；

如果显示220bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n3亚型禽流感病毒；

如果显示152bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n4亚型禽流感病毒；

如果显示300bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n5亚型禽流感病毒；

如果显示240bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n6亚型禽流感病毒；

如果显示198bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n7亚型禽流感病毒；

如果显示177bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n8亚型禽流感病毒；

如果显示210bp±3bp范围内的峰，待测病毒为n9亚型禽流感病毒；

所述方法的目的为鉴定待测病毒是否为禽流感病毒，如果是禽流感病毒其所属的h亚型和n亚型。

本发明还保护一种方法，包括如下步骤：

以待测样本的cdna为模板，采用所述引物组合进行gexp多重pcr，然后采用gexpsystem进行检测分析；

如果显示163bp±3bp范围内的峰，待测样本含有禽流感病毒；

如果显示229bp±3bp范围内的峰，待测样本含有h5亚型禽流感病毒；

如果显示144bp±3bp范围内的峰，待测样本含有h7亚型禽流感病毒；

如果显示332bp±3bp范围内的峰，待测样本含有h9亚型禽流感病毒；

如果显示249bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n1亚型禽流感病毒；

如果显示285bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n2亚型禽流感病毒；

如果显示220bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n3亚型禽流感病毒；

如果显示152bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n4亚型禽流感病毒；

如果显示300bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n5亚型禽流感病毒；

如果显示240bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n6亚型禽流感病毒；

如果显示198bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n7亚型禽流感病毒；

如果显示177bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n8亚型禽流感病毒；

如果显示210bp±3bp范围内的峰，待测样本含有n9亚型禽流感病毒；

所述方法的目的为鉴定待测样本是否含有禽流感病毒，如果含有禽流感病毒其所含有的禽流感病毒所属的h亚型和n亚型。

为了建立h5、h7和n9亚型组合9个na亚型禽流感病毒gexp检测方法，本发明的发明人提供了13对特异性引物，13对特异性引物组成引物组合。本发明的发明人对于引物组合进行了特异性、敏感性、干扰性、稳定性验证。13重反应体系能对应扩增出单一、几种随机混合、13种混合的核酸模板，特异性强，对常见的禽病病原体新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等不存在交叉反应。同时鉴别13种目的基因的检测下限为10²拷贝/μl。对不同浓度的不同模板同时进行检测，与单一模板的检测无明显差别，表明13重引物之间干扰性小。在同一时间和不同时间对相同模板进行检测，表明重复性好，稳定性佳。应用本发明提供的引物组合配套gexp检测方法可以在同一个反应体系中进行13重pcr扩增，有效鉴定h5、h7和n9亚型组合9个na亚型，具有高通量、快速、省时省力的优点，为快速鉴别h5、h7和n9亚型组合9个不同的na亚型aiv提供了有效方法，应用前景广阔。

附图说明

图1为实施例4中，采用模板溶液1时，13重反应体系同时检测13个目的片段的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

rna/dna共提试剂盒：北京全式金生物技术有限公司。gexpsystem为美国贝克曼公司产品。gexp启动试剂盒、毛细管阵列、上样缓冲液、dnasizestandardkit-400basepairs、分离缓冲液和分离胶均为absciex公司产品。nanodropnd-1000核酸微量检测仪为thermo公司产品。

实施例1、引物的获得和制备

通过大量序列分析、引物设计、引物验证和引物筛选，获得13个引物对。引物对aiv-m由正向引物(序列表的序列1)和反向引物(序列表的序列2)组成，用于鉴定禽流感病毒。引物对h5由正向引物(序列表的序列3)和反向引物(序列表的序列4)组成，用于鉴定h5亚型禽流感病毒。引物对h7由正向引物(序列表的序列5)和反向引物(序列表的序列6)组成，用于鉴定h7亚型禽流感病毒。引物对h9由正向引物(序列表的序列7)和反向引物(序列表的序列8)组成，用于鉴定h9亚型禽流感病毒。引物对n1由正向引物(序列表的序列9)和反向引物(序列表的序列10)组成，用于鉴定n1亚型禽流感病毒。引物对n2由正向引物(序列表的序列11)和反向引物(序列表的序列12)组成，用于鉴定n2亚型禽流感病毒。引物对n3由正向引物(序列表的序列13)和反向引物(序列表的序列14)组成，用于鉴定n3亚型禽流感病毒。引物对n4由正向引物(序列表的序列15)和反向引物(序列表的序列16)组成，用于鉴定n4亚型禽流感病毒。引物对n5由正向引物(序列表的序列17)和反向引物(序列表的序列18)组成，用于鉴定n5亚型禽流感病毒。引物对n6由正向引物(序列表的序列19)和反向引物(序列表的序列20)组成，用于鉴定n6亚型禽流感病毒。引物对n7由正向引物(序列表的序列21)和反向引物(序列表的序列22)组成，用于鉴定n7亚型禽流感病毒。引物对n8由正向引物(序列表的序列23)和反向引物(序列表的序列24)组成，用于鉴定n8亚型禽流感病毒。引物对n9由正向引物(序列表的序列25)和反向引物(序列表的序列26)组成，用于鉴定n9亚型禽流感病毒。

各条引物的核苷酸序列以及各个引物对的扩增片段大小见表1。各条正向引物中具有相同的gexp通用引物，见下划线标记。各条反向引物中具有相同的gexp通用引物，见下划线标记。

表1

表1中，r表示a或g，y表示c或t，s表示g或c，w表示a或t，h表示a、t或c。表1中，*，根据实际检测的毒株不同以及gexp系统如genomelabtmgexpgeneticanalysissystem毛细管电泳仪的误差，使用上述引物对检测获得的实际扩增长度可在预计扩增产物的长度基础上下波动3bp。

人工合成各条引物。

实施例2、各引物对的特异性

一、模板的制备

1、病毒rna提取及cdna的获得

①病毒rna提取

使用试剂盒easypureviraldna/rnakit(北京全式金生物技术有限公司，产品目录号er201)按照试剂盒说明书，分别从如下病毒毒株的鸡胚尿囊液中提取rna(以提取阴性鸡胚尿囊液获得的rna为阴性对照样品)：禽流感病毒毒株：a/sparrow/guangxi/gxs-1/2012(h1n2亚型)、a/chicken/guangxi/dx/2008(h9n2亚型)、a/duck/guangxi/n42/2009(h3n2亚型)、a/duck/hk/77/76(h2n3亚型)、a/duck/hk/876/80(h10n3亚型)、a/turkey/ontario/6118/68(h8n4亚型)、a/duck/guangxi/gxd-1/2009(h6n5亚型)、a/duck/hk/862/80(h12n5亚型)、a/duck/guangxi/070d/2010(h4n6亚型)、a/duck/guangxi/gxd-6/2010(h6n8亚型)、a/duck/pa/2099/12(h11n9亚型)、a/gull/md/704/77(h13n5亚型)、a/mallard/astrakhan/263/82(h14n5亚型)、a/shearwater/westernaustralia/2576/79(h15n9亚型)、a/shorebird/delaware/168/06(h16n3亚型)和新城疫病毒毒株(ndv)f48、传染性支气管炎病毒毒株(ibv)m41(记载在以下文献：罗思思，谢芝勋，谢丽基，等.h7亚型和n9亚型禽流感病毒rt-lamp可视化检测方法的建立[j].畜牧兽医学报2015,46(7)：1176-1183.)；禽流感病毒毒株：a/duck/guangxi/gxd-5/2010(h6n1亚型)(记载在以下文献：罗思思，谢芝勋，周辰瑜，等.h6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析[j].中国家禽，2015,37(2)：54-56.)；禽流感病毒毒株：a/pigeon/guangxi/020p/2009(h3n6亚型)(记载在以下文献：tingtingliu,zhixunxie,guoliwang,etal.avianinfluenzaviruswithhemagglutinin-neuraminidasecombinationh3n6,isolatedfromadomesticpigeoninguangxi,southernchina[j].genomeannounc,2015feb5；3(1).pii:e01537-14.)；禽呼肠孤病毒s1133毒株(记载在以下文献：张昆丽，谢芝勋，黄莉，等.禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后il-17、il-18和ifn-γmrna转录水平的动态变化[j].2015,35(3)：345-349.)。

②cdna的获得

将步骤①获得的rna样品分别按照如下反应体系(50μl)和反应条件进行反转录，得到cdna；以depc水作为阴性对照。

rna35μl、50pmolrandomprimer(9mer)1.4μl，70℃反应10min后立即冰浴5min，然后加入5×reversetranscriptasebuffer10μl、10mmdntpmixture2μl、40u/μlribonucleaseinhibitor0.6μl、200u/μlm-mlvreversetranscriptase1μl。

反转录试剂randomprimer(9mer)、dntpmixture、ribonucleaseinhibitor、m-mlvreversetranscriptase，均购自大连takara公司，目录号分别为d3802、d4019、d2313a、d2641a。

反应条件：42℃1h，置于-20℃保存。

2、禽流感病毒毒株a/chicken/qt35/98(h5n9亚型)、a/duck/42846/07(h7n7亚型)、h7n9fieldsamples(h7n9亚型)、duck/hk/47/76(h7n2亚型)、duck/guangxi/1/04(h5n1亚型)分别是以cdna形式留存的样品，并已经ha基因测序证实(h5n9、h7n7、h7n9记载在以下文献：罗思思，谢芝勋，谢丽基，等.h7亚型和n9亚型禽流感病毒rt-lamp可视化检测方法的建立[j].畜牧兽医学报2015,46(7)：1176-1183；h5n1和h7n2记载在以下文献：zhixunxie,yao-shanpang,jiaboliu,etal.amultiplexrt-pcrfordetectionoftypeainfluenzavirusanddifferentiationofavianh5,h7,andh9hemagglutininsubtypes[j].molecularandcellularprobes,2006,20(3-4):245-249)。

二、取步骤一得到的cdna，作为模板，采用供试引物对进行gexp单重pcr，然后采用gexpsystem(gexp毛细管电泳系统)进行检测分析。

供试引物对分别为：实施例1制备的各个引物对。

反应体系(20μl)：5×pcrbuffer4μl、引物溶液2μl、25mmmgcl2水溶液4μl、jumpstarttaqdnapolymerase1μl、模板cdna2μl，加dh2o至20μl。

5×pcrbuffer：含gexp通用引物对，购自上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，目录号a85017。jumpstarttaqdnapolymerase购自sigma公司，货号d4184。

引物溶液提供两种有效成分，供试引物对的正向引物和反向引物。反应体系中，正向引物的终浓度为20nm、反向引物的终浓度为20nm，jumpstarttaqdnapolymerase的含量为2.5u、模板cdna的含量为1pg-10pg。

反应程序：95℃5min；95℃30s、50℃30s、72℃40s，35个循环；72℃8min。

引物对aiv-m对于所有亚型禽流感病毒均显示163bp的目的峰。引物对aiv-m对于新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒，均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对h5对于h5n9亚型禽流感病毒和h5n1亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示229bp的目的峰。引物对h5对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对h7对于h7n7亚型禽流感病毒、h7n9亚型禽流感病毒和h7n2亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示144bp的目的峰。引物对h7对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对h9对于h9n2亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示332bp的目的峰。引物对h9对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n1对于h6n1亚型禽流感病毒和h5n1亚型禽流感病毒均实现了特异性扩增，均显示249bp的目的峰。引物对n1对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n2对于h1n2亚型禽流感病毒、h9n2亚型禽流感病毒、h3n2亚型禽流感病毒和h7n2亚型禽流感病毒均实现了特异性扩增，均显示285bp的目的峰。引物对n2对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n3对于h2n3亚型禽流感病毒、h10n3亚型禽流感病毒和h16n3亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示220bp的目的峰。引物对n3对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n4对于h8n4亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示152bp的目的峰。引物对n4对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n5对于h6n5亚型禽流感病毒、h12n5亚型禽流感病毒、h13n5亚型禽流感病毒和h14n5亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示300bp的目的峰。引物对n5对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n6对于h4n6亚型禽流感病毒和h3n6亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示240bp的目的峰。引物对n6对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n7对于h7n7亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示198bp的目的峰。引物对n7对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n8对于h6n8亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示177bp的目的峰。引物对n8对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

引物对n9对于h11n9亚型禽流感病毒、h15n9亚型禽流感病毒、h5n9亚型禽流感病毒和h7n9亚型禽流感病毒实现了特异性扩增，显示210bp的目的峰。引物对n9对于其他各个病毒均未实现有效扩增，不显示任何峰。

结果表明，13个引物对均特异性扩增目标病毒，对其它病毒无交叉扩增。

实施例3、引物组合的特异性

一、模板的制备

同实施例2的步骤一。

二、取步骤一得到的cdna，作为模板，采用供试引物对进行gexp多重pcr，然后采用gexpsystem(gexp毛细管电泳系统)进行检测分析。

引物组合由实施例1设计的13个引物对组成。

反应体系(20μl)：genomelabgexpstartkit5×pcrbuffer4μl、引物组合溶液2μl、25mmmgcl2水溶液4μl、taqdnapolymerase1μl、模板cdna2μl，加dh2o至20μl。

genomelabgexpstartkit5×pcrbuffer：含gexp通用引物对，购自上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，目录号a85017。

引物组合溶液提供所述的13个引物对。反应体系中，每条正向引物的终浓度均为20nm、每条反向引物的终浓度均为20nm，taqdnapolymerase的含量为2.5u、模板cdna的含量为1pg-10pg。

反应程序同实施例2。

对于新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒，引物组合均未实现有效扩增，不显示任何峰。

对于h1n2亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和285bp的目的峰(对应引物对n2)。

对于h9n2亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)、332bp的目的峰(对应引物对h9)和285bp的目的峰(对应引物对n2)。

对于h3n2亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和285bp的目的峰(对应引物对n2)。

对于h2n3亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和220bp的目的峰(对应引物对n3)。

对于h10n3亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和220bp的目的峰(对应引物对n3)。

对于h8n4亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和152bp的目的峰(对应引物对n4)。

对于h6n5亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和300bp的目的峰(对应引物对n5)。

对于h12n5亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和300bp的目的峰(对应引物对n5)。

对于h4n6亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和240bp的目的峰(对应引物对n6)。

对于h6n8亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和177bp的目的峰(对应引物对n8)。

对于h11n9亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和210bp的目的峰(对应引物对n9)。

对于h13n5亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和300bp的目的峰(对应引物对n5)。

对于h14n5亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和300bp的目的峰(对应引物对n5)。

对于h15n9亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和210bp的目的峰(对应引物对n9)。

对于h16n3亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和220bp的目的峰(对应引物对n3)。

对于h6n1亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和249bp的目的峰(对应引物对n1)。

对于h3n6亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)和240bp的目的峰(对应引物对n6)。

对于h5n9亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)、229bp的目的峰(对应引物对h5)和210bp的目的峰(对应引物对n9)。

对于h7n7亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)、144bp的目的峰(对应引物对h7)和198bp的目的峰(对应引物对n7)。

对于h5n1亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)、229bp的目的峰(对应引物对h5)和249bp的目的峰(对应引物对n1)。

对于h7n9亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)、144bp的目的峰(对应引物对h7)和210bp的目的峰(对应引物对n9)。

对于h7n2亚型禽流感病毒，引物组合实现了特异性扩增，显示163bp的目的峰(对应引物对aiv-m)、144bp的目的峰(对应引物对h7)和285bp的目的峰(对应引物对n2)。

实施例4、引物组合的灵敏度

一、构建质粒

分别以实施例2中步骤一的h5n1亚型禽流感病毒、h9n2亚型禽流感病毒、h7n2亚型禽流感病毒、h2n3亚型禽流感病毒、h8n4亚型禽流感病毒、h12n5亚型禽流感病毒、h3n6亚型禽流感病毒、h7n7亚型禽流感病毒、h6n8亚型禽流感病毒和h7n9亚型禽流感病毒的cdna样品为模板，pcr扩增获得h9n2亚型禽流感病毒m基因、h5n1亚型禽流感病毒ha基因、h7n2亚型禽流感病毒ha基因、h9n2亚型禽流感病毒ha基因、h5n1亚型禽流感病毒na基因、h9n2亚型禽流感病毒na基因、h2n3亚型禽流感病毒na基因、h8n4亚型禽流感病毒na基因、h12n5亚型禽流感病毒na基因、h3n6亚型禽流感病毒na基因、h7n7亚型禽流感病毒na基因、h6n8亚型禽流感病毒na基因和h7n9亚型禽流感病毒na基因的全长cdna片段，分别与pgem-teasyvector载体连接，获得13种重组质粒pgem-t-m、pgem-t-h5、pgem-t-h7、pgem-t-h9、pgem-t-n1、pgem-t-n2、pgem-t-n3、pgem-t-n4、pgem-t-n5、pgem-t-n6、pgem-t-n7、pgem-t-n8和pgem-t-n9，经测序证实这13种重组质粒分别插入了上述基因，做为敏感性试验用的标准品。

二、制备模板

将步骤一制备的13种质粒混合，制备模板溶液。模板溶液1中，13种质粒的浓度均为10³拷贝/μl。模板溶液2中，13种质粒的浓度均为10²拷贝/μl。模板溶液3中，13种质粒的浓度均为10¹拷贝/μl。

三、取步骤二得到的模板溶液，采用引物组合进行gexp多重pcr。

反应体系同实施例3。

反应程序同实施例2。

四、完成步骤三后，取pcr产物，采用gexpsystem(gexp毛细管电泳系统)进行检测分析。

结果显示，10³拷贝/μl、10²拷贝/μl的质粒模板均能检测到，10¹拷贝/μl的质粒绝大部分已检测不到。采用模板溶液1时，13重反应体系同时检测13个目的片段的结果见图1。

实施例5、干扰性试验

一、制备模板

模板溶液1中，重组质粒pgem-t-h5的浓度为10³拷贝/μl、重组质粒pgem-t-h7的浓度为10⁷拷贝/μl。模板溶液2中，重组质粒pgem-t-h7的浓度为10⁴拷贝/μl、重组质粒pgem-t-n7的浓度为10²拷贝/μl、重组质粒pgem-t-n9的浓度为10⁶拷贝/μl。模板溶液3中，重组质粒pgem-t-n3的浓度为10³拷贝/μl、重组质粒pgem-t-n5的浓度为10⁷拷贝/μl、重组质粒pgem-t-n6的浓度为10⁵拷贝/μl、重组质粒pgem-t-n8的浓度为10²拷贝/μl。

二、取步骤一得到的模板溶液，采用引物组合进行gexp多重pcr。

反应体系同实施例3。

反应程序同实施例2。

三、完成步骤二后，取pcr产物，采用gexpsystem(gexp毛细管电泳系统)进行检测分析。

均出现对应的目的峰，高浓度和低浓度的模板均检测到，干扰性小，多模板的检测和单模板的检测荧光信号值相差不大。

实施例6、稳定性试验

1、批内重复性

在同一时间内对每种供试病毒进行6次重复试验，方法均同实施例3。

2、批间重复性

在不同时间内对每种供试病毒进行6次重复试验，方法均同实施例3。

批内和批间的检测结果均一致，稳定性佳。

实施例7、对比引物

一、对比试验一

用引物对n7-d代替引物对n7，其他同实施例3。

引物对n7-d由如下正向引物和反向引物组成(预期扩增片段为262bp)：

正向引物：aggtgacactatagaatagaacacattggarcayacaagt；

反向引物：gtacgactcactatagggagcattrggtatyttcaacat。

无法有效检测到引物对n2、引物对n4和引物对h5对应的目的峰。

二、对比试验二

用引物对n4-d代替引物对n4，其他同实施例3。

引物对n4-d由如下正向引物和反向引物组成(预期扩增片段为154bp)：

正向引物：aggtgacactatagaatagatgcwaatggrtgggtgtc；

反向引物：gtacgactcactatagggaaccggttgtttctcctctaat。

无法有效检测到引物对n1、引物对n3、引物对n6和引物对h7对应的目的峰。

三、对比试验三

用引物对n2-d代替引物对n2，用引物对n3-d代替引物对n3，用引物对n8-d代替引物对n8，其他同实施例3。

引物对n2-d由如下正向引物和反向引物组成(预期扩增片段为188bp)：

正向引物：aggtgacactatagaataatgttatcartttgcacttgggcag；

反向引物：gtacgactcactatagggaatgctatgcacacytgtttggttc。

引物对n3-d由如下正向引物和反向引物组成(预期扩增片段为177bp)：

正向引物：aggtgacactatagaatagagatatgcattgcttggtc；

反向引物：gtacgactcactatagggactccatgatttaatggagtc。

引物对n8-d由如下正向引物和反向引物组成(预期扩增片段为280bp)：

正向引物：aggtgacactatagaataatgtgtaccaggcaaggtttga；

反向引物：gtacgactcactatagggatttgctggtccatccgtcatta。

无法有效检测到引物对n1、引物对n4、引物对n6、引物对h5和引物对h9对应的目的峰。

sequencelisting

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>用于检测h5、h7和h9以及9个na亚型aiv的引物组合及其应用

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