全血样本长期保存方法及RNA提取方法与流程

本发明涉及一种血液样本保存和rna提取方法，尤其是涉及一种用于提取rna的人全血样本的长期保存和rna提取的方法。

背景技术：

随着21世纪初人类基因组计划(humangenomeproject)的完成，生命科学进入后基因组时代，转录组学、蛋白组学和代谢组学等新的组学研究应运而生。在中心法则中，rna是连接dna与蛋白质的桥梁，反映了细胞功能状态的动态变化。转录组学从rna水平上研究基因表达情况，在探究疾病发生和发展的生物机制中发挥了重要作用。近年来在临床医学、流行病学、分子生物学等领域得到了越来越多的应用。rna的提取是rna-seq、微阵列检测、rt-pcr、northernblot等实验的基础，rna的质量对rna研究的结果有很大的影响，只有提取出完整性较好、纯度较高的rna才能进行下游各种分析。

在人的基因表达研究中，全血是一种侵入性较低且有价值的rna来源，常被用来提取rna。与dna不同，rna为单链结构，rna核糖残基的2'和3'位置带有羟基，化学性质活泼、结构不稳定。同时由于内源性和外源性的rna酶无处不在，使得rna在保存、运输、提取等过程中非常容易降解，给rna的提取带来了很大的困难。因此，大部分研究在全血收集后，需要尽快对rna进行提取。目前人全血rna提取方法主要有trizol试剂法、paxgene血液rna试剂盒法等。paxgene血液rna试剂盒价格非常昂贵，且需配套使用paxgene静脉真空采血管，对于样本量较大的研究来说，成本较高、难以推广。而trizol试剂法是一种经典的rna抽提方法，操作简单且价格相对较低。

但现有的trizol试剂法还存在以下不足：

1.全血rna含量极少，传统trizol试剂法需要从全血中先分离出有核细胞，操作较为繁琐且会损失部分白细胞，使得此方法对样本的需求量较大，一般需要2.5ml全血。

2.全血需要分装到不含rna酶的1.5ml离心管进行预处理，经离心、分离血浆、得到白膜层并裂解红细胞后得到白细胞，或先进行红细胞裂解后得到白细胞。对于在短时间内收集大量生物样本的研究而言工作量非常繁重。

3.由于rna自身结构及rna酶等因素的影响，现有技术要求采血后尽快提取rna，全血保存时间增长，rna降解风险增加。而临床生物样本库、流行病学等研究的生物样本往往需要长期保存，根据研究需要再进行rna的提取和后续分析，目前亟需长期保存用于提取rna的全血样本的方法。

4.现有技术提取出全血rna的纯度较低。提取过程大多在不含rna酶的1.5ml离心管中进行，体系较小，洗涤等过程中可能导致碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂残留，使得od260/230(指示rna纯度的指标)较低。对于全血量多的情况，需要分成若干管进行提取，增加了操作步骤和时间，容易引入影响rna质量的风险因素。

5.在rna洗涤后的晾干过程中，自然晾干时间较长，使得rna暴露于环境中rna酶的可能性增加，从而导致降解风险增大。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够长期保存用于提取rna的全血样本的简单易行的方法，进一步的，提供对经该方法长期保存的样品进行rna提取的方法，获得具有高完整性和高纯度的总rna。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：

将采集到的新鲜全血立即与5～15体积的trizol试剂充分混匀，均质化后于-80℃冰箱中保存。此方法可实现对用于提取rna的全血样本的长期保存。

优选的，将采集的新鲜全血立即与10倍体积的trizol试剂混匀，然后在-80℃冰箱中保存。

上述方法在采血后无需分离血浆、裂解红细胞，也无需将全血分装到若干个不含rna酶的1.5ml离心管中。将新鲜全血和trizol试剂在不含rna酶的容器(如不含rna酶的15ml离心管)中混匀，形成全血-trizol混合体系。trizol试剂是rna的释放剂和保护剂，相较于直接冻存全血，此方法使得rna与全血内源rna酶相隔离，从而能保护rna不被降解。

上述方法可以有效保存用于提取rna的全血样本一年以上，后续对全血-trizol混合体系提取总rna，能够得到高完整性和高纯度的总rna。

本发明提供的全血-trizol混合体系提取总rna的方法，包括以下步骤：

1)将全血-trizol混合体系在4℃解冻，转移至不含rna酶的离心管中，加入氯仿振荡混匀，室温孵育约3～5分钟，然后在4℃离心进行相分离，取上层水相于新的不含rna酶的离心管中；

2)在步骤1)取得的水相中加入-20℃预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃条件下孵育20～30分钟，然后在4℃离心，离心管底部和/或侧壁形成凝胶样总rna沉淀，弃去上清；

3)用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，depc)处理水与无水乙醇配制的75％乙醇溶液重复洗涤总rna多次；

4)晾干总rna沉淀，然后用depc处理水重新溶解总rna，保存在-80℃冰箱中或进行检测。

上述步骤1)中，氯仿的加入量为保存时所加入trizol试剂量的20％(体积比)，大力上下振荡离心管0.5～1.5分钟，涡旋振荡10～20秒，室温孵育3分钟，然后将混合体系以12000g转速在4℃条件下离心15～25分钟；离心后，混合体系分离为红色下层(酚-氯仿相)、白色中间层以及无色上层水相，rna存在于水相中，水相体积约为保存时所加入trizol试剂量的60％。

上述步骤2)中，预冷异丙醇的加入量为保存时所加入trizol试剂量的50％(体积比)，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃条件下孵育20～30分钟，然后以12000g转速在4℃条件下离心20～30分钟，离心后在管底部和/或侧壁形成凝胶样总rna沉淀。此步骤在15ml离心管中进行。

上述步骤3)中，用75％乙醇溶液重复洗涤总rna三次，第1次洗涤过程：在步骤2)的15ml离心管中加入3ml75％乙醇溶液，轻轻摇动使沉淀重新悬浮，涡旋振荡15秒，以7500g转速在4℃条件下离心8分钟后弃去上清；第2次洗涤过程：加入1ml75％乙醇溶液，将15ml离心管中的rna沉淀转移至不含rna酶的1.5ml离心管，涡旋振荡15s，以7500g转速在4℃条件下离心5分钟后弃去上清；第3次洗涤过程：加入1ml75％乙醇溶液，涡旋振荡15秒，以7500g转速在4℃条件下离心5分钟后弃去上清。

上述步骤4)中，将弃去上清的装有rna沉淀的1.5ml离心管以7500g转速在4℃条件下继续离心2分钟后，用20μl移液枪小心吸去多余液体(有利于缩短rna晾干时间)，再晾干总rna沉淀。

对于根据本发明方法从人全血中提取出的总rna，检测其总量、纯度和完整性，如使用3.0荧光计(lifetechnologies,ca,usa)对总rna浓度和总量进行检测，使用分光光度计(implen,ca,usa)对总rna纯度进行检测，使用agilent2100rnanano6000assaykit(agilenttechnologies,ca,usa)对总rna完整性进行评估，经质检合格的rna样本用于后续分析，如转录组测序、微阵列检测、rt-pcr、northernblot实验等。

相对于现有技术，本发明的优势体现在：

1.针对传统trizol法需要分离有核细胞、对全血样本需求量大的情况，本发明可以实现少量全血(如0.5ml全血)直接提取足够量(约2μg)的总rna用于下游分析。

2.采血后无需分装、也无需分离血浆、裂解红细胞等繁琐的步骤，直接将全血与trizol试剂混匀，简化操作步骤，减少采样工作量。

3.针对全血中存在大量rna酶的情况，直接冻存全血会使rna被内源rna酶降解，本发明用trizol试剂先处理全血，使其均质化再冻存，可以实现对用于提取rna的全血样本的长期保存。

4.增大操作体系(如在15ml离心管中进行提取)，增加洗涤液量和洗涤次数，避免因分管引入导致rna降解的风险因素，使总rna的完整性和纯度全面提高。

5.洗涤完成后增加离心并吸取多余液体的步骤，缩短rna晾干时间，降低rna与rna酶接触的风险。

附图说明

图1实施例1中第一组本发明方法提取保存一年全血总rna的完整性(a)和纯度(b)检测结果；

图2实施例1中第二组本发明方法提取保存一年半全血总rna的完整性(a)和纯度(b)检测结果；

图3实施例1中第三组本发明方法提取保存两年全血总rna的完整性(a)和纯度(b)检测结果；

图4实施例1中第四组分管提取保存一年全血总rna的完整性(a)和纯度(b)检测结果；

图5实施例1中第五组分管提取保存一年全血并自然晾干总rna的完整性(a)和纯度(b)检测结果；

图6实施例2用于转录组测序的全血总rna完整性(a)和纯度(b)检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明的用于提取rna的人全血的长期保存及rna提取方法，但不以任何方式限制本发明的范围。

所用到的试剂和仪器如表1所示：

表1.人全血的长期保存及rna提取所用到的试剂及仪器

实施例1：流行病学研究中人全血的长期保存及总rna提取

在流行病学研究中，研究者在基线调查和随访研究中会收集大量生物样本，其中人全血是常见的生物样本之一。高效快速收集和保存生物样本是流行病学研究中至关重要的一环。对于某些特定类型的研究，如队列研究、巢式病例对照研究等，研究者收集生物样本后，不会立即对生物样本进行分析，而是长期保存后再分析，这对生物样本的稳定性提出了非常高的要求。对于人全血rna提取来说，由于rna自身结构不稳定且环境中处处存在rna酶，现有技术要求采集人全血后，分装至1.5ml离心管，对全血进行离心分离血浆、裂解红细胞，然后尽快对rna进行提取。本发明无需对全血进行分装，也无需分离血浆、裂解红细胞，而是直接将少量全血样本与trizol试剂混匀，均质化后长期保存，并提取出高质量的总rna。

本实施例为2016年至2017年期间开展的流行病学研究，利用本发明对随访期间受试者全血样本进行采集、保存及总rna提取，并与不同处理条件下的结果进行对比。

1.全血采集及保存

(1)试剂准备：用移液枪将5mltrizol试剂加入不含rna酶的15ml离心管中。

(2)全血采集及处理：由医院专业护士采集受试者空腹静脉血，采血后无需分离血浆、裂解红细胞，也无需将全血分装到若干个1.5ml离心管里，立即用移液枪将0.5ml全血转移至装有5mltrizol试剂的离心管中，用移液枪吹吸混匀，形成5.5ml全血-trizol混合体系，保护rna不被降解。

(3)全血保存：待均质化后长期保存于-80℃冰箱中(一年至两年)，待后续提取总rna。

2.全血-trizol混合体系提取总rna

(1)实验环境：人全血总rna提取实验全程在超净实验室进行，超净实验室内配备超净工作台。实验开始前及结束后，用紫外灯对超净实验室及超净工作台进行灭菌处理90分钟。实验过程中经常用rna酶去除试剂及75％乙醇擦拭洁净工作台、移液枪、离心机等。

(2)试剂准备：将异丙醇放于-20℃冰箱预冷，使用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，depc)处理水与无水乙醇配置75％乙醇溶液(现用现配，实验专用)。

(3)样品解冻：将trizol试剂处理后的5.5ml全血-trizol混合液从-80℃冰箱中取出，在4℃完全融化，用移液枪吹吸混匀后转移至新的不含rna酶的15ml离心管中。

(4)相分离：在离心管中加入1ml氯仿，大力上下振荡离心管1分钟，涡旋振荡15秒，室温孵育3分钟。将混合体系以12000g转速在4℃条件下离心20分钟。离心后，混合体系分离为红色下层(酚-氯仿相)、白色中间层以及无色上层水相，rna存在于水相中，水相体积约为所加入trizol试剂量的60％。

(5)上层水相吸取：用移液枪(1ml枪头前端套20μl枪头)小心吸取上层水相，将水相转移至新的不含rna酶的15ml离心管中。

(6)总rna沉淀：加入预冷的异丙醇(以1mltrizol加入0.5ml异丙醇计算)，轻轻上下颠倒混匀后，在-20℃条件下孵育30分钟。然后以12000g转速在4℃条件下离心30分钟，离心后在管底部和/或侧壁形成凝胶样总rna沉淀。

(7)总rna洗涤：弃去上清后重复用depc处理水与无水乙醇配制的75％乙醇溶液洗涤总rna3次。第1次洗涤过程：加入3ml75％乙醇溶液，轻轻摇动使沉淀重新悬浮，涡旋振荡15秒，以7500g转速在4℃条件下离心8分钟后弃去上清；第2次洗涤过程：加入1ml75％乙醇溶液，用1ml移液枪枪头将15ml离心管中的rna沉淀转移至不含rna酶的1.5ml离心管，涡旋振荡15s，以7500g转速在4℃条件下离心5分钟后弃去上清；第3次洗涤过程：加入1ml75％乙醇溶液，涡旋振荡15秒，以7500g转速在4℃条件下离心5分钟后弃去上清。

(8)总rna晾干：将弃去上清的装有rna沉淀的1.5ml离心管以7500g转速在4℃条件下继续离心2分钟后，用20μl移液枪小心吸去多余液体(有利于缩短rna晾干时间)，晾干总rna沉淀。

(9)重新溶解总rna：加入20μldepc处理水，用移液枪轻轻吹吸，使rna沉淀完全溶解，保存在-80℃冰箱中或进行质量检测。

3.总rna质量检测

对于从人全血提取出的总rna，检测其总量、纯度、完整性，只有质检合格的rna样本才能进行后续分析，如转录组测序、微阵列检测、rt-pcr、northernblot实验等。

(1)使用3.0荧光计(lifetechnologies,ca,usa)对总rna浓度和总量进行检测。

(2)使用分光光度计(implen,ca,usa)对总rna纯度进行检测。od260/230指示rna样本的纯度。纯rna的od260/230＝2.5，若od260/230＜2.0，表明样品存在碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染。

(3)使用agilent2100rnanano6000assaykit(agilenttechnologies,ca,usa)对总rna完整性进行评估。rin值(rnaintegritynumber)为衡量rna完整性的重要指标，范围为0至10，数值越高，表明rna越完整，一般要求rin值大于7.0。

不同处理方法与本发明结果比较：

第一组：本发明方法提取保存一年全血

五份人全血样本编号a1至a5，按照本发明方法进行总rna提取，结果如图1所示。a1至a5样本的rin值分别为9.0、9.2、9.0、8.7、9.0，rin值均大于7.0。a1至a5样本的od260/230分别为2.2、2.2、2.1、2.2、2.2，od260/230均大于2.0。表明本发明方法可以实现少量全血样本的长期保存并提取出完整性好、纯度高的总rna。

第二组：本发明方法提取保存一年半全血

五份人全血样本编号b1至b5，按照本发明方法进行总rna提取，结果如图2所示。b1至b5样本的rin值分别为8.2、8.2、8.8、8.4、9.4，相较于第一组保存一年的全血，保存一年半的全血提取出的总rna的rin值略有降低，但完整性仍然较高。b1至b5样本的od260/230分别为2.2、2.0、2.3、2.2、2.1，均大于2.0，与保存一年提取出的总rna纯度相比，保存一年半提取出的总rna纯度未发生明显变化。

第三组：本发明方法提取保存两年全血

五份人全血样本编号c1至c5，按照本发明方法进行总rna提取，结果如图3所示。c1至c5样本的rin值分别为8.6、8.5、8.3、8.2、8.7，保存两年的全血总rna的rin值均大于7.0。c1至c5样本的od260/230分别为2.1、2.1、2.2、2.0、2.1，保存两年全血提取出的总rna纯度均大于2.0。表明本发明能够实现人全血保存两年并提取出高质量的总rna。

第四组：分管提取保存一年全血

五份人全血样本编号d1至d5，与本发明方法的主要不同之处为：将混合体系等分为5份，在不含rna酶的1.5ml离心管中进行总rna提取后将总rna合并，结果如图4所示。d1至d5样本的rin值分别为8.3、7.9、7.7、7.5、7.5，低于本发明方法提取出rna的rin值。表明本发明全血未经过分管提取再合管，减少了操作步骤和时间，降低了总rna与环境中rna酶接触发生降解的可能性，使提取出的总rna完整性高。d1至d5样本的od260/230分别为0.7、0.5、0.7、1.1、0.8，od260/230均小于2.0，与第一组至第三组相比，分管提取出总rna的纯度很低。表明本发明全血-trizol体系不分装至1.5ml离心管，直接在较大的体系中(15ml离心管)提取并增加洗涤液量和洗涤次数，显著提高了全血总rna的纯度。

第五组：分管提取保存一年全血并自然晾干

五份人全血样本编号e1至e5，与本发明方法的主要不同之处为：将混合体系等分为5份，在不含rna酶的1.5ml离心管中进行总rna提取后将总rna合并，不增加离心并吸取多余液体这一步骤，使总rna自然晾干，结果如图5所示。e1至e5样本的rin值分别为3.1、2.5、4.1、6.1、3.0，自然晾干的rna出现了严重降解情况。e1至e5样本的od260/230分别为0.4、0.8、0.6、0.8、0.7，od260/230均小于2.0，样品纯度很低。表明本发明增加离心并吸取多余液体这一步骤有利于提高总rna的完整性和纯度。

实施例2：人全血长期保存及总rna提取并进行转录组测序

利用本发明对5份长期保存的全血样本进行总rna提取、质量检测，编号f1至f5，并通过二代测序平台illuminahiseqxten对5份人全血rna进行转录组测序。rna质量检测的结果如图6所示，提取出的总rna的完整性和纯度均很高。转录组测序的结果如表2所示。cleanreadsrate和cleanq30basesrate是转录组测序的两个重要评价指标。cleanreadsrate指原始数据过滤后剩余的reads数占原始未过滤reads数的比例，这个数值越大，说明测序质量或者文库质量越好。cleanq30baserate指原始数据过滤后，总序列中质量值大于30(错误率小于0.1％)的碱基数的比例，该值越大说明测序质量越好。由表2可知，5个全血rna样本测序原始数据进行数据过滤处理后，cleanreadsrate和cleanq30baserate均大于90％。由此说明，本发明利用少量全血提取出的总rna可以用于转录组研究，并得到高质量测序数据。

表2.转录组测序数据统计表

备注：

(1)rawreadsnumber：原始未过滤数据的reads数；

(2)cleanreadsnumber：过滤后剩余的reads数；

(3)cleanreadsrate(％)：过滤后剩余的reads数占原始未过滤reads数的比例；

(4)low-qualityreadsrate(％)：被低质量过滤标准去掉的reads的比例；

(5)nsreadsrate(％)：由于含n过高，被去掉的序列占原始下机序列的比例；

(6)adapterpollutedreadsrate(％)：去掉含有接头污染的reads数占原始未过滤reads数的比例；

(7)cleanq30baserate(％)：过滤后，总序列中质量值大于30(错误率小于0.1％)的碱基数的比例。