猪笼草wcor413-like蛋白及其应用的制作方法

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种猪笼草wcor413-like蛋白及其在抗寒中的应用。

背景技术：

植物对环境的改变具有适应力和抵抗力，在众多的不良环境因素中，温度是限制植物生长、发育的最重要因素。研究发现，植物经历逐渐降低的温度能够提高其抗寒能力，这一过程被称为低温驯化。植物的低温驯化包括许多生理和分子反应。植物抗寒的生理生化反应是由于低温改变基因表达所引起的，目前已经克隆了许多抗寒相关基因。探索植物抗寒性的遗传机理不仅在基础理论上具有重要意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。

植物抗寒基因表达是一种诱发性的基因表达，以避免或减轻低温对植物造成的伤害，增加植物的抗寒性。这些基因的克隆对于研究植物的抗寒分子机理及作物的抗寒育种具有重要意义。siminovitch和briggs(1949)最早发现植物低温诱导蛋白，随后weiser提出了“植物抗冷性诱导过程是基因表达改变”的观点。guy等(1990)发现菠菜在5℃诱导下有新mrna出现，为weiser的观点提供了有力的证据。目前已经分离并鉴定的低温诱导基因有：拟南芥的lti140、lti78、lti68、rab18、rd28、rd29和cor15a，大麦的hva1、blt101和blt14，小麦的wcs120和cor39，以及水稻的lip15等，这些低温诱导基因除受低温应答外，有些还对aba、盐、水分胁迫等作出应答。

猪笼草(nepenthessp.)属于热带食虫植物，原产地主要为旧大陆热带地区。其拥有一个独特的吸取营养的器官-捕虫笼，捕虫笼呈圆筒形，下半部稍膨大，笼口上具有盖子，因其形状像猪笼而得名。猪笼草作为一种热带植物，对温度变化比较敏感，低温会导致其分泌大量的低温诱导蛋白，尚没有报道猪笼草低温诱导蛋白克隆及应用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种猪笼草wcor413-like蛋白及其在抗寒中的应用。

本发明在猪笼草(nepenthessp.)中克隆得到了一个植物家族wcor413-like冷诱导蛋白，并研究其在植物抗寒中的应用。

一种猪笼草wcor413-like蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)自序列表中seqidno：1所示的氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的seqidno：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。

所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因序列如序列表seqidno：2所示。

一种含所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因载体。

含有所述猪笼草wcor413-like蛋白的基因载体的工程菌。

扩增所述的猪笼草wcor413-like蛋白的基因中任一片段的引物。

一种猪笼草wcor413-like蛋白突变体，所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体的氨基酸序列如序列表seqidno：3所示；突变位点为蛋白的氨基酸序列第40，41位氨基酸残基由im突变为tt。

所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体的基因序列如序列表seqidno：4所示。

所述猪笼草wcor413-like蛋白或所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体在植物抗寒中的应用。

所述猪笼草wcor413-like蛋白突变体在植物抗虫中的应用。

本发明的有益效果：本发明在热带植物猪笼草中克隆得到了一个wcor413-like蛋白基因，该wcor413-like蛋白在冷诱导条件下大量表达，表达丰度高，具有抵抗植物低温胁迫的应用潜力，其中wcor413-like蛋白的一个突变体还具有抗虫的功能。

附图说明

图1为本发明猪笼草wcor413-like蛋白基因鉴定电泳图；

图中，maker：1kbmaker，1.p2301-nwcor413(13120bp)，2.p2301-nwcor413/ecori+hindiii(1541bp+11579bp)。

图2为本发明构建的pcambia2301-nwcor413载体结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1猪笼草wcor413-like蛋白的克隆

根据烟草(nicotianatabacum)的wcor413-like蛋白(loc107779465)基因保守区序列设计简并引物：

fw:5’-attgattcagatttgaaggaaatt-3’(seqidno：5)；

rv:5’-acgatcccaacagtgtttgaaat-3’(seqidno：6)；

利用同源克隆技术以提取的猪笼草rna反转录得到的cdna为模板，通过pcr扩增获得了约500bp的基因片段，然后通过3’和5’race技术克隆得到了该基因的全长cdna序列，序列分析表明：该基因cdna全长为913bp(seqidno:7)，开放读码框为612bp，编码204个氨基酸的前体蛋白(电泳图检测如图1所示)。该猪笼草低温诱导基因命名为nwcor413。

下面详细阐述nwcor413基因的克隆过程。

1.反转录生成cdna第一链

(1)在0.2ml离心管中加入下列试剂：总rna2μg，500μg/ml锚定引物oligod(t)151μl，补水至15μl，70℃变性5min，迅速置冰上冷却。

(2)按顺序加入下列组分：

amv5×reactionbuffer5μl；dntpmix,10mm1.5μl；rnaseinhibitor0.5μl；rna5μl；amvrt1μl；oligodt1μl；mgcl24μl，补水至20μl。

(3)混匀后42℃温浴30min，然后99℃温浴5min，最后置于5℃环境中。

2.pcr反应获得中间片段

(1)配制pcr反应液：

10xpcrbuffer(含mg²⁺)6μl；反转录cdna2μl；taq酶0.8μl；fw引物1.5μl；rv引物1.5μl；dntpmix2μl；补水至50μl。

(2)pcr反应：

94℃预热3min；94℃30s,55℃30s,72℃45s,上述步骤35个循环；72℃延伸10min。

3.3’race

按照invitrogen公司3’racesystemforrapidamplificationofcdnaends,version2.0操作说明书进行。

(1)反转录反应体系如下：

rna1μg；3′race反转录引物(5μm)1μl；5×反转录酶缓冲液2μl；dntpmixture(10mm)1μl；rnase抑制剂(40u/μl)0.25μl；反转录酶(150u/μl)0.3μl；无rnase的去离子水5μl；总体积10μl。

(2)反应条件如下：

30℃10min；42℃60min；99℃5min；5℃5min。

(3)套式pcr反应。

使用takarala(takaracode：drr02am)进行pcr反应时的实验操作如下：

第一轮pcr反应，反应体系如下：

上述的反转录反应液10μl；基因特异引物1(10μm)2μl；3’race一轮引物(10μm)2μl；10×lataqbufferii5μl；10×lataqbufferii5μl；mgcl(25mm)3μl；la(5u/μl)0.5μl；去离子水27.5μl；总体积50μl；

反应条件如下：

96℃预热6min；94℃30s,55℃30s,72℃1min,上述步骤20个循环；72℃延伸10min。

第二轮pcr反应，反应体系如下：

上轮pcr产物1μl；dntpmixture(2.5mmeach)2μl；10×lataq(无mg²⁺)5μl；mgcl2(25mm)3μl；lataq(5u/μl)0.5μl；基因特异引物2(10μm)2μl；3′race二轮引物(10μm)2μl；去离子水34.5μl；总体积50μl。

反应条件如下：

96℃预热6min；94℃30s,55℃30s,72℃1min,上述步骤34个循环；72℃延伸10min。

4.5’race

按照invitrogen公司5’racesystemforrapidamplificationofcdnaends,version2.0操作说明书进行。

(1)获得cdna第一链

1、配制反应液：合成反转录引物2.5pmol；rna4μg；depch2o至16μl。

2、于70℃加热10min，使rna变性，然后置于冰上1min，用离心机离一下，然后加入如下组分：10xpcrbuffer2.5μl；25mmmgcl22.5μl；10mmdntp1μl；0.1mdtt2.5μl；步骤1配制的反应液16μl。

3、离心使步骤2的体系混匀，在42℃温浴1min。

4、加入1μl反转录酶superscripttmⅱrt,混匀。

5、在70℃温浴15min，终止反应。

6、用离心机离心10-20s，然后置于37℃。

7、加入1μlrnasemix轻轻混匀后于37℃下放置30min，使cdna:rna链中rna降解掉。

8、离心收集样品，然后置于冰上。

(2)、s.n.a.p去除包含在cdna中的蛋白、dntps、引物、dna

1、将结合液放置于室温条件下；

2、每纯化一个样品，取约100μl无菌水，于65℃预热备用；

3、向cdna液中加入120μl结合液；

4、将结合液/cdna加入柱子中，12000rpm离心20s；

5、将吸附柱从收集管中移走，将管中的液体转到另一离心管中，保存该溶液直至确定回收回来了cdna，然后重新将吸附柱放到收集管中；

6、向柱子中加入冰预冷的1x的400μl洗脱液，于12000rpm下离心20s，抛弃洗脱液，重复此过程4次；

7、用400μl70％乙醇洗涤柱子，按照步骤6的方法洗涤两次；

8、洗脱完毕后，丢弃70％乙醇，于12000rpm下空甩1min；

9、将柱子放置到一个新的样品收集管中，向柱子中加入约50μl65℃预热的灭菌蒸馏水，然后于13000rpm下离心20s，收集cdna。

(3)、tdt加尾

1、配制反应液：depch2o6.5μl；5x加尾buffer5.0μl；2mmdctp2.5μl；上轮柱纯化cdna10.0μl。

2、在94℃下孵育2-3min，然后立即置于冰上1min，通过离心收集下样品，然后置于冰上；

3、向离心管中加入1μl的tdt，轻轻混匀，然后在37℃下孵育10min；

4、在65℃下加热10min，然后离心收集样品。

(4)、pcr反应

1、一轮pcr反应的反应体系如下：

10xpcrbuffer5μl；25mmmgcl23μl；10mmdntps1μl；外轮引物2μl；aap2μl；dc-tailedcdna5μl；taq酶0.5μl；h2o31.5μl。

反应条件如下：

94℃预热5min；94℃30s,55℃45s,72℃1min,上述步骤32个循环；72℃总延伸10min。

2、二轮pcr反应的反应体系如下：

10xpcrbuffer5μl；25mmmgcl23μl；10mmdntps1μl；内侧引物2μl；auap2μl；一轮dna1μl；taq酶0.5μl；去离子水35.5μl。

反应条件如下：

94℃预热4min；94℃30s,55℃45s,72℃1min,上述步骤32个循环；72℃总延伸10min。

5.全长的获得

(1)根据3’端测序序列和5’端测序序列，进行拼接，然后从编码框两头设计引物，引物的5’端加入合适的酶切位点从cdna和基因组dna中进行pcr。

(2)反应体系如下：

10xexbuffer5μl；10xexbuffer5μl；dntps2μl；上游引物1.5μl；下游引物1.5μl；extaq0.5μl；dnaorcdna1μl；去离子水38.5μl

(3)反应条件如下：

94℃预热5min；94℃30s,55℃45s,72℃1min,上述步骤32个循环；72℃总延伸10min

将获得的猪笼草nwcor413基因构建camv35s启动子驱动，camv35s-pola终止的植物表达载体(pcambia2301-nwcor413，如图2所示)，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得了35s启动子驱动的nwcor413基因的转基因烟草植株。克隆得到的nwcor413基因表达框：smai-camv35s-nwcor413-camv35s-pola-xbair,经双酶切连接载体pcambia2301。

实施例2突变体获得

利用p2300-35s-nwcor413植物表达载体为模版，通过重叠延伸pcr的方法获得突变体，突变位点为第40和第41位氨基酸残基im突变为tt。重新构建植物表达载体p2300-35s-nwcor413’，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得了35s启动子驱动的nwcor413’基因的转基因烟草植株。

实施例3抗寒实验

植物在低温下膜结构受到破坏，破坏程度随温度的降低而增加。膜的破坏程度可以通过细胞内电解质外渗率，即相对电导率的大小来判断。植物的抗寒能力与相对电导率成反比。电解质渗出率达50％得出的半致死温度能够更加准确的反映植物的抗寒性。

测试时，选取野生型烟草，转nwcor413烟草及转nwcor413’烟草的叶片，试验材料用去离子水洗2次，用洁净的滤纸吸干表面水分，剪成大小相同的段，称取0.5g(每个样品重复3次)，放入青霉素小瓶中，加10ml去离子水，放入真空干燥箱中抽真空，待材料呈半透明状，沉入水下时，停止抽真空；室温下放置1h，期间多次摇动；用电导仪测定初电导率(s1)；测毕，沸水浴10min，取出后用自来水冷却至室温，摇匀，测定终电导率(s2)。代入下列公式计算相对电导率：

相对电导率＝s1/s2

测试结果见表1：

表1

注：*代表与野生型烟草比较p<0.05。

由表1可以看出，转nwcor413烟草和转nwcor413’烟草在各温度的相对电导率均显著低于野生型烟草，在-5℃取样的野生型样品已经超过50％，达到半致死温度。证明本发明克隆的nwcor413基因具有良好的植物抗寒特性。

实施例4抗蚜虫试验

种植转nwcor413基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到55天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转nwcor413基因的烟草植株20株，野生型烟草20株，每株烟草上接100头成熟无翅的蚜虫，30小时后，统计蚜虫抑制率：蚜虫抑制率％＝(100-叶片上剩余蚜虫)/100。

实验结果：转nwcor413基因的烟草的蚜虫抑制率为62％，野生型烟草的蚜虫抑制率为1％。

种植转nwcor413’基因的烟草和野生型烟草，烟草生长到55天，苗期将要结束的时候，取生长大小一致，叶片数目一致的烟草植株，转nwcor413’基因的烟草植株20株，野生型烟草20株，每株烟草上接100头成熟无翅的蚜虫，30小时后，统计蚜虫抑制率：蚜虫抑制率％＝(100-叶片上剩余蚜虫)/100。实验结果：转nwcor413’基因的烟草的蚜虫抑制率为92％，野生型烟草的蚜虫抑制率为1％。

序列表

<110>北京大宏利辉生物科技中心

<120>猪笼草wcor413-like蛋白及其应用

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>204

<212>prt

<213>猪笼草(nepenthessp.)

<400>1

metglyilelyslyssertyrleualametlysthraspalaalaval

151015

alaseraspleuileaspseraspleulysgluileglyphealaala

202530

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65707580

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130135140

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165170175

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180185190

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195200

<210>2

<211>612

<212>dna

<213>猪笼草(nepenthessp.)

<400>2

atggggataaagaaaagttatttggcaatgaagacagatgcagcagtagcaagtgatctt60

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<213>猪笼草(nepenthessp.)

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<211>612

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<213>猪笼草(nepenthessp.)

<400>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>23

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

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<213>猪笼草(nepenthessp.)

<400>7

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