基于小鼠小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法与流程

本发明涉及一种基于小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法。

背景技术：

营养物质的功效是评价食品功效和食品营养的重要指标，肠道又是人体最大的营养物质消化和吸收器官，因此，在肠道层面上食物对肠道表型特征的影响能够直观快速的反应食物的功效。过去，食物对小肠生长特性的影响评价以实验动物为主，存在操作步骤多，耗时长，成本高，动物使用量大，动物不同个体之间存在大的差异性等缺点。而近十年发展起来的，以肠道干细胞或以含干细胞的隐窝为基础体外培养形成的肠道类器官，完全再现了体内肠道细胞组成及结构形成过程，除此之外，肠道类器官体外培养还具有培养周期短、可多次传代、高通量、高内涵及易于体外基因操作等优点，被广泛应用与医药及基础科学研究领域。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法。该方法区别于现有技术，通过以完全再现体内小肠结构及形成特征的类器官为基础，优化了食物暴露小肠类器官方法，普通倒置显微镜动态记录肠道类器官生长过程，通过肠道类器官生长表型特征参数-类器官形成率、扩增率及单个类器官出芽率，实现食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法，包括以下几个步骤：

步骤一、将培养3代以上冻存小肠类器官复苏后，24孔培养板1中培养4-5天，去除完全培养基，24孔培养板1的每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液1；用注射器吸取全部复合凝胶悬液1后推出，重复一次，使隐窝类似结构从小肠类器官中释放，得到解离小肠类器官悬液1；将解离小肠类器官悬液1转移至15毫升离心管1中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管1中上清液；向含有解离小肠类器官悬液1的离心管1中加入150-200微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液2；将复合凝胶悬液2按照每孔5微升体积接种于37℃预热96孔培养板1中，每孔小肠类器官密度为30-80个/孔；将96孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向96孔培养板1的孔中加入120微升含特定浓度食物成分的完全培养基，不含食物成分的完全培养基作为对照，随后每2天更换一次相应培养基；

步骤二、步骤一中，类器官接种于96孔板1两小时后，4倍显微镜全景记录类器官状态，培养24小时后4倍显微镜再次全景记录类器官状态，随后培养5或6天后，再次4倍显微镜再次全景记录类器官状态；

步骤三、分析步骤二中的接种2小时、24小时和5-6天后小肠类器官特征参数，包括：记录培养2小时96孔板1中每孔单个类隐窝或囊状结构个数，记为参数a；记录培养24小时96孔板1中囊形结构表面积，记为参数b；记录培养5-6天与培养24小时记录相对应小肠类器官表面积，记为参数c；记录培养5-6天与培养2h相对应每个小肠类器官形成芽体个数，然后求和得参数d；记录培养5-6天与培养2h相对应形成典型多芽体类器官个数，记为参数e；

步骤四、根据步骤三中获得类器官生长特征参数a，b，c，d和e，获得小肠类器官生长表型参数1：类器官形成率＝e/a，表征肠道类器官存活率；参数2：类器官扩增率＝c/b，表征肠道干细胞分化能力；参数3：单个类器官出芽率＝d/统计类器官个数，表征肠道类器官增殖及分化能力。

进一步地，所述完全培养基由r-spondin条件培养基、noggin条件培养基、dmem/f12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽、青霉素、链霉素、表皮生长因子、神经元细胞培养补充剂n2和b27，rho相关形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶卷曲螺旋抑制剂y27632组成。

所述复合凝胶液提取自小鼠肉瘤，由粘连蛋白、胶原蛋白iv、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、转化生长因子-β、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子和组织纤溶酶原激活剂组成。

本发明中食物成分用完全培养基溶解。

本发明具有以下优点及有益效果：

相比于现有的技术方法，本发明提供的方法具有以下几个显著的优点和进步：

1、本发明的技术方法，优化了食物成分暴露肠道类器官方法，保证类器官基础上食物成分功效评价的顺利进行。

2、本发明的技术方法，使用了小肠类器官，来自不同区段的小肠类器官完全可以再现组织来源的功能特征，可以一次性实现食物成分在不同肠段中的作用。

3、本发明的技术方法，使用了96孔板，提高了一次性分析食物成分功效的效率，包括分析食物成分种类及同种食物成分浓度范围，实现了分析方法的高通量及高内涵。

4、本发明的技术方法，使用小肠类器官生长表型特征参数作为评价指标，实现器官基础上的食物成分功效快速评价。

附图说明

图1是绿原酸暴露小肠类器官生长图及生长特征图。

其中a图左上是对照组传代后培养2小时回肠类器官形态代表图，右上是对照组培养5天回肠类器官形态代表图，左下是绿原酸暴露组培养2小时回肠类器官形态代表图，右下是绿原酸暴露组培养5天回肠类器官形态代表图。

b图是类器官形成率统计结果图。

c图是类器官面积扩增率统计结果图。

d图是类器官出芽率统计结果图。

具体实施例

本发明公开了一种基于小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速评价方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。

为更好地阐述本发明，下面通过实施例来说明。

实施例1：

步骤一、将培养3代以上冻存回肠类器官复苏后，24孔培养板1中培养4-5天，去除完全培养基，24孔培养板1的每孔中加入500微升预冷的无钙、镁离子磷酸盐缓冲溶液后置于冰上，用移液枪反复吹打每个孔的复合凝胶至破碎，得到复合凝胶悬液1；用注射器吸取全部复合凝胶悬液1后推出，重复一次，使隐窝类似结构从回肠类器官中释放，得到解离回肠类器官悬液1；将解离回肠类器官悬液1转移至15毫升离心管1中，以200g转速和4℃温度下离心10分钟，去除离心管1中上清液；向含有解离回肠类器官悬液1的离心管1中加入150-200微升冰上预融化的复合凝胶液，用移液枪吹打3-4次制成冰上预融化的复合凝胶悬液2；将复合凝胶悬液2按照每孔5微升体积接种于37℃预热96孔培养板1中，每孔回肠类器官密度为30-80个/孔；将96孔培养板1置于温度为37℃的二氧化碳培养箱中30分钟；待复合凝胶完全聚合后，再向96孔培养板1的孔中加入120微升含终浓度为1mm绿原酸的完全培养基，不含食物成分的完全培养基作为对照，随后每2天更换一次相应培养基；培养第三天用不含绿原酸完全培养基替换含绿原酸完全培养基。

步骤二、步骤一中，类器官接种于96孔板1两小时后，4倍显微镜全景记录类器官状态，培养24小时后4倍显微镜再次全景记录类器官状态，随后培养5或6天后，再次4倍显微镜再次全景记录类器官状态；图1a为传代后对照组和绿咖啡提取食物活性成分绿原酸暴露条件下，培养2h及第5天回肠类器官形态代表性图片，传代后典型回肠类器官解离呈类隐窝结构或囊状结构，而培养5天后再次生长形成典型多芽体类器官结构。

步骤三、imagej软件分析步骤二中，接种2小时、24小时和5-6天后小肠类器官特征参数，包括：记录培养2小时96孔板1中每孔单个类隐窝或囊状结构个数，记为参数a；记录培养24小时96孔板1中囊形结构表面积，记为参数b；记录培养5-6天与培养24小时记录相对应回肠类器官表面积，记为参数c；记录培养5-6天与培养2h相对应每个回肠类器官形成芽体个数，然后求和得参数d；记录培养5-6天与培养2h相对应形成典型多芽体类器官个数，记为参数e。

步骤四、根据步骤三中获得类器官生长特征参数a,b,c,d,e，获得回肠类器官生长表型参数1：类器官形成率＝e/a，表征肠道类器官存活率；参数2：类器官扩增率＝c/b，表征肠道干细胞分化能力；参数3：单个类器官出芽率＝d/统计类器官个数，表征回肠类器官增殖及分化能力。图1b-d分别为回肠类器官形成率、类器官面积扩增率及单个类器官出芽率结果图，表1是回肠类器官形成率、类器官面积扩增率及单个类器官出芽率的数据。

表1回肠类器官形成率、类器官面积扩增率及单个类器官出芽率结果

结果表明：绿原酸可以增强肠组织存活率及增强肠道组织的增殖及分化能力，但对肠道干细胞的分化能力无显著影响。

因此，从上述步骤和结果可以看出，本发明提供了一种基于小肠类器官的食物功效成分对小肠生长特性影响的快速且有效的评价方法。

以上所述仅是本发明的特定实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。