本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法。
背景技术：
白桦脂酸(betulinicacid，简称ba)是一类五环羽扇烷型的三萜化合物。近年来的研究表明，ba具有多种多样的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、抗疟疾等，尤其是在抗肿瘤和抗hiv方面，特别是针对黑色素肿瘤细胞具有专一的杀死作用，因此得到了广泛关注。更重要的是ba衍生物抗hivii期临床实验已经取得成功，所以ba目前已被认为是最具潜力的药物先导化合物之一。最近，大量的体内外实验证明白桦脂酸还具有其他临床功能。白桦脂酸可以减缓乙醇诱导的肝星状细胞的激活，通过抑制肝葡萄糖的产生来缓解高血糖症，增强免疫应答，通过抑制胰脂肪酶达到减肥的效果，还可以保护心肌免受由于缺血再灌注引起的损伤以及有助于治疗化学性的甲状腺功能低下症。
目前ba的制备方法，主要有以下三种：1天然提取法，2化学合成法，3微生物转化法。目前，白桦脂酸植物提取的主要来源是白桦树皮，但其中ba含量很低，仅为0.025％～2％。天然提取法虽然方法简单，但是ba在植物中的含量很少，因此对原料的消耗极大，杂质较多，产率低下，还没有潜在的工业化价值。白桦脂酸早在1938年已被化学合成，均是以白桦脂醇为原料，经过一系列氧化还原反应最终生成白桦脂酸。目前，化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然合成效果较好，但存在操作复杂、污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中的应用，有待进一步改善提高。微生物转化法是利用生物在代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物催化反应得到目标产物。与化学合成方法相比，微生物转化具有高立体选择性、反应条件温和、污染小、费用低，这种方法具有工业化的潜力。目前有几种真菌已被证实可以完成白桦脂醇到白桦脂酸转化，分别为armillarialuteo-virenssacczjuqh100-6、cunninghamellablakesleeana、aspergillusfoetiduszu-g1和aspergillusoryzaeas3.498，但产率仍然不能满足商业化需求。
代谢工程和合成生物学的快速发展为在微生物宿主内获得高产的天然产物提供了很好的解决方法，但现在很少有将这些技术应用到白桦脂醇的转化方面的研究。白桦脂醇转化生成白桦脂酸是c28位的羟基氧化为羧基，可通过基因工程的手段将具有c28位氧化功能的基因与相应的还原酶基因导入酿酒酵母完成转化。目前，已发现的具有c-28位氧化功能的基因有来自medicagotruncatula的cyp716a12，vitisvinifera的cyp716a15，panaxginseng的cyp716a52v2和catharanthusroseus的cyp716al1。
技术实现要素：
本发明提供了一种利用重组酿酒酵母与桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸方法，提高了桦褐孔菌生物转化合成白桦脂酸的得率。
一种利用重组酿酒酵母和桦褐孔菌混菌体系制备白桦脂酸的方法，包括：将重组酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)w303-1加入到桦褐孔菌(inonotusobliquus)cfcc83414培养体系中，于20-30℃混合发酵培养2-5天，培养完成后，收集桦褐孔菌cfcc83414的菌体和发酵液，通过后处理从菌体和发酵液中分离纯化得到白桦脂酸。
所述重组酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)w303-1b保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：m2015662，保藏日期为2015年11月5日。授权公告号cn105385614b的发明专利“一种重组酿酒酵母及其构建方法与应用”中公开了所述的重组酿酒酵母及其构建方法，该重组酿酒酵母含有蒺藜状苜蓿cyp716a12和拟南芥atr1基因，能同时表达cyp716a12氧化酶和atr1还原酶，此cyp716a12基因和atr1基因克隆于双向表达载体质粒pesc-ura上。
所述桦褐孔菌(inonotusobliquus)cfcc83414菌株购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cfcc83414，保藏时间2007年7月30日。
所述重组酿酒酵母zjuqh311可以采用经活化、诱导的活酵母菌体或破碎酵母菌体。作为优选，采用破碎酵母菌体，破碎酵母可以促进单位质量桦褐孔菌cfcc83414中白桦脂酸含量的积累，且加入的酵母量越高，白桦脂酸的含量越高。
所述破碎酵母菌体可通过如下方法制备：将经活化、诱导的重组酿酒酵母zjuqh311用tek缓冲液稀释，于300-400w条件下冰浴超声10-20min，得到破碎酵母菌体。
所述桦褐孔菌cfcc83414培养体系为经过预培养的桦褐孔菌cfcc83414液体培养体系。
所述预培养方法为：将活化的桦褐孔菌cfcc83414加入液体培养基，在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养2-5天。
作为优选，所述重组酿酒酵母w303-1在桦褐孔菌cfcc83414培养体系中的加入量为102-108cfu/ml。加入该添加量的破碎酵母菌体，能有效提高桦褐孔菌的生物量及对白桦脂酸的转化得率。
所述后处理包括将菌体破碎后用乙酸乙酯萃取，同时将发酵液用乙酸乙酯萃取，分别浓缩，得到白桦脂酸。
本发明利用重组酿酒酵母-桦褐孔菌混菌体系直接转化葡萄糖合成白桦脂酸，制备方法简单，周期短，后期处理方便，能有效提高桦褐孔菌转化生成白桦脂酸的得率，产量最高达到19.52μg，单位质量桦褐孔菌中白桦脂酸含量与对照组相比最高提高145.5％，为桦褐孔菌中白桦脂酸合成调控及工业化生产提供了一种新的思路。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1混菌体系对桦褐孔菌生物量的影响
(1)将桦褐孔菌cfcc83414接种到斜面上，在20-30℃的培养箱中培养12-18天左右，待其长满整个斜面。每一个月更新一次斜面。
(2)每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌。在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养。
(3)将诱导获得的工程酵母菌株接种、活化，诱导培养。
(4)如表1所示，分为直接加入活酵母和加入破碎的酵母菌体进行混合发酵。
直接加入酵母组：将诱导取得的工程酵母计数，一部分用生理盐水进行洗涤，稀释成109、107、105个/ml三个梯度的菌液，然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的工程酵母菌总量分别为108、106、104cfu。
加入破碎后的酵母组：将诱导获得的工程酵母，取一部分于2000g离心5-10min，将沉淀菌体重悬于1ml的tek缓冲液中，稀释成105、107、109cfu/ml三个梯度，于300-400w的条件下冰浴超声10-20min。然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的破碎工程酵母总量分别为104、106、108cfu，即102、104、106cfu/ml。
(5)发酵结束后，先用500目的筛网来筛掉酿酒酵母，收集桦褐孔菌。
(6)生物量测定：将发酵液及菌体倒入50ml离心管，在3000-3500r/min的转速下离心8-10min，将发酵液和菌体细胞分离。菌体用去离子水洗2次后用冻干机冻干除去水分，然后称其干重。
实验结果：在加入活酵母时，桦褐孔菌的生物量会随着加入的酵母量的增多而逐渐增加。但在加入的酵母量最高时，桦褐孔菌的生物量也仅仅与空白组的量持平，并没有显著增加。破碎的酵母的加入会抑制桦褐孔菌菌丝体的生长，且加入的破碎酵母量越多，桦褐孔菌的生物量越低，破碎的酵母加入量分别为102、104、106cfu/ml时，桦褐孔菌的生物量分别比对照组减少了11.5％、20.5％、20.3％。目前，出现这种现象的原因尚不明确，推测酵母的破碎液中可能含有抑制桦褐孔菌生长的物质。
实施例2混菌体系对桦褐孔菌中白桦脂酸含量的影响
(1)将桦褐孔菌cfcc83414接种到斜面上，在20-30℃的培养箱中培养12-18天左右，待其长满整个斜面。每一个月更新一次斜面。
(2)每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌。在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养。
(3)将诱导获得的工程酵母菌株接种、活化，诱导培养。
(4)如表1所示，分为直接加入活酵母和加入破碎的酵母菌体进行混合发酵。
直接加入酵母组：将诱导取得的工程酵母计数，一部分用生理盐水进行洗涤，稀释成109、107、105个/ml三个梯度的菌液，然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的工程酵母菌总量分别为108、106、104cfu。
加入破碎后的酵母组：将诱导获得的工程酵母，取一部分于2000g离心5-10min，将沉淀菌体重悬于1ml的tek缓冲液中，稀释成105、107、109cfu/ml三个梯度，于300-400w的条件下冰浴超声10-20min。然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的破碎工程酵母总量分别为104、106、108cfu，即102、104、106cfu/ml。
(5)发酵结束后，先用500目的筛网来筛掉酿酒酵母，收集桦褐孔菌。
(6)胞内白桦脂酸测定：将得到的菌体加入一定量的水进行破碎，用超声破碎仪破碎5次，每次1min，加入等量的乙酸乙酯进行萃取，60℃，400w下提取1h，萃取2次，合并上层有机相，3500r/min离心20min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22μm的有机相微孔滤膜过滤后用rp-hplc法检测。
实验结果：活酵母的加入并没有促进桦褐孔菌中白桦脂酸的产生，活酵母加入后，桦褐孔菌中白桦脂酸的含量随着活酵母加入量的增加而逐渐减少。
与活酵母的诱导效果形成鲜明对比的是，超声破碎后的工程酵母的加入可以促进单位质量桦褐孔菌中白桦脂酸含量的积累，且加入的酵母量越高，白桦脂酸的含量越高。当破碎的酵母加入量分别为102、104、106cfu/ml时，单位质量桦褐孔菌中白桦脂酸含量与对照组相比，分别提高了62.3％、15.4％、145.5％。
实施例3混菌体系对桦褐孔菌中白桦脂酸总含量的影响
(1)将桦褐孔菌cfcc83414接种到斜面上，在20-30℃的培养箱中培养12-18天左右，待其长满整个斜面。每一个月更新一次斜面。
(2)每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌。在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养。
(3)将诱导获得的工程酵母菌株接种、活化，诱导培养。
(4)如表1所示，分为直接加入活酵母和加入破碎的酵母菌体进行混合发酵。
直接加入酵母组：将诱导取得的工程酵母计数，一部分用生理盐水进行洗涤，稀释成109、107、105个/ml三个梯度的菌液，然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的工程酵母菌总量分别为108、106、104cfu。
加入破碎后的酵母组：将诱导获得的工程酵母，取一部分于2000g离心5-10min，将沉淀菌体重悬于1ml的tek缓冲液中，稀释成105、107、109cfu/ml三个梯度，于300-400w的条件下冰浴超声10-20min。然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的破碎工程酵母总量分别为104、106、108cfu，即102、104、106cfu/ml。
(5)发酵结束后，先用500目的筛网来筛掉酿酒酵母，收集桦褐孔菌。
(6)胞内白桦脂酸测定：将得到的菌体加入一定量的水进行破碎，用超声破碎仪破碎5次，每次1min，加入等量的乙酸乙酯进行萃取，60℃，400w下提取1h，萃取2次，合并上层有机相，3500r/min离心20min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22μm的有机相微孔滤膜过滤后用rp-hplc法检测。
(7)胞外白桦脂酸：取一定体积的发酵液，加入等量的乙酸乙酯进行萃取，60℃，400w下提取1h，萃取2次，合并上层有机相，3500r/min离心20min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22μm的有机相微孔滤膜过滤后用rp-hplc检测。
加入工程酵母后，桦褐孔菌中胞内白桦脂酸的总含量与单位质量桦褐孔菌中白桦脂酸的含量的变化趋势一致。加入活酵母后，桦褐孔菌中白桦脂酸的总含量降低，且与活酵母的加入量呈负相关。破碎的酵母加入总体上促进了桦褐孔菌中白桦脂酸的代谢形成，且在加入量分别为102、106cfu/ml时，胞内白桦脂酸的总量比对照分别提高了41.9％和112.2％。
实施例4不同处理方法对桦褐孔菌胞内白桦脂酸的总含量的影响
(1)将桦褐孔菌cfcc83414接种到斜面上，在20-30℃的培养箱中培养12-18天左右，待其长满整个斜面。每一个月更新一次斜面。
(2)每个摇瓶接种1块1cm2的桦褐孔菌。在20-30℃温度下培养，先静置2-5天，然后再以150-200rpm的转速培养。
(3)将诱导获得的工程酵母菌株接种、活化，诱导培养。
(4)如表2所示，分为破碎酵母、油酸&激发子、法尼醇、茉莉酸甲酯、活酵母五组进行混合发酵。
①加入破碎后的酵母组：将诱导获得的工程酵母，取一部分于2000g离心5-10min，将沉淀菌体重悬于1ml的tek缓冲液中，稀释，于300-400w的条件下冰浴超声10-20min。然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的破碎工程酵母浓度为106cfu/ml。
②油酸&激发子组：将油酸用0.22μm的无菌有机系滤膜过滤除菌后保存在4℃冰箱中待用。先将黑曲霉接种于pda斜面培养基上并在25±1℃培养7d，然后转入pdb液体培养基中，20-28℃条件下震荡培养3d(摇床转速为140r/min)。真菌培养物应在培养结束后取，3500r/min离心10min，菌丝体用蒸馏水洗涤3次，用50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph7.2)洗涤3次，用jy96-iiv超声波细胞粉碎机破碎细胞(300w，1min×5)，3500r/min离心10min后取沉淀。在显微镜下观察时，菌丝体应均为碎片状。然后用上述缓冲液洗涤3次，蒸馏水洗涤3次。用冻干机冻干后称量其质量，再用蒸馏水配制成10mg/ml的黑曲霉细胞碎片溶液，高压蒸汽灭菌后，制备真菌激发子，置于4℃冰箱中保存备用。
在桦褐孔菌发酵第6天时，实验组分别添加油酸0.5-2.0g/l&激发子40-50mg/l。
③法尼醇组：先将法尼醇配制成1m的储备液，然后稀释成50mm的工作浓度。称取0.2224g法尼醇，然后溶于1ml的dmso中，得到1m的储备液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌然后稀释20倍，得到50mm的工作液，发酵液中分别添加法尼醇250-350μm，正常的发酵过程中，在发酵第6天加入。
④茉莉酸甲酯组：先将茉莉酸甲酯溶解在20％的吐温80中，配置成1mol/ml的储备液，采用0.22μm的无菌的有机系滤膜过滤除菌，之后用无菌的20％的吐温80稀释成5mmol/ml工作液。最后，按需要发酵液中加入不同体积的工作液。
⑤直接加入酵母组：将诱导取得的工程酵母计数，一部分用生理盐水进行洗涤，稀释，然后各取0.1ml加入到发酵了两天的100ml桦褐孔菌液体培养基中，使得每瓶桦褐孔菌培养基中加入的工程酵母菌浓度为为102cfu/ml。
(5)发酵结束后，先用500目的筛网来筛掉酿酒酵母，收集桦褐孔菌。
(6)胞内白桦脂酸测定：将得到的菌体加入一定量的水进行破碎，用超声破碎仪破碎5次，每次1min，加入等量的乙酸乙酯进行萃取，60℃，400w下提取1h，萃取2次，合并上层有机相，3500r/min离心20min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22μm的有机相微孔滤膜过滤后用rp-hplc法检测。
(7)胞外白桦脂酸：取一定体积的发酵液，加入等量的乙酸乙酯进行萃取，60℃，400w下提取1h，萃取2次，合并上层有机相，3500r/min离心20min，旋转蒸发浓缩，然后用色谱纯的甲醇溶解，0.22μm的有机相微孔滤膜过滤后用rp-hplc检测。
实验结果：在破碎的酵母加入量为106cfu/ml时，桦褐孔菌胞内的白桦脂酸总含量达到最高，为19.52μg。对于活的工程酵母，酵母的加入量为102cfu/ml时，桦褐孔菌胞内的白桦脂酸总含量最高为7.34μg。与之前的诱导剂相比，若仅考虑桦褐孔菌菌体中的白桦脂酸总含量，0.5-2.0g/l油酸和40-50mg/l真菌激发子的组合诱导剂在最佳条件下，桦褐孔菌胞内的白桦脂酸总量为16.97μg，75-150μm茉莉酸甲酯在最佳诱导条件下桦褐孔菌胞内的白桦脂酸总量为8.75μg，250-350μm法尼醇在最佳诱导条件下桦褐孔菌胞内的白桦脂酸总量为12.37μg，因此若只考虑桦褐孔菌菌体中的白桦脂酸，混菌发酵法中的破碎酵母诱导法最为有效，油酸和激发子的组合次之。由于此工程酵母最初来源为酿酒酵母，因此破碎的酵母诱导法对于工业中从液体发酵的桦褐孔菌中提取白桦脂酸具有极高的应用价值。
显著性分析结果表明，除了加入75-150μm茉莉酸甲酯和加入102cfu/ml的活酵母这两组之间无显著性差异外，其余各组两两之间均存在显著性差异(p＜0.05)。
表1桦褐孔菌-酵母混合发酵分组
表2不同处理方法对桦褐孔菌胞内白桦脂酸的总含量的影响
注：数据表示为平均值±标准差；
每列中呈显著性差异(p＜0.05)的数值用不同字母标注。