一种脂肪酶在拆分N-乙酰-DL-甲硫氨酸甲酯中的应用的制作方法

本发明属于生物催化
技术领域：
，涉及一种脂肪酶立体选择性催化水解拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯对映体合成单一构型的n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯对映体的应用。(二)
背景技术：
：n-乙酰-l-甲硫氨酸(n-ac-l-met)是一种有价值的营养补充剂，由l-甲硫氨酸(l-met)的化学乙酰化产生，通过酰基转移酶催化n-乙酰-dl-甲硫氨酸(n-ac-dl-met)的拆分制备。dl-met是用于n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯(n-ac-dl-metome)生产的材料，通过化学合成以低成本大规模生产。已经提出了酶催化n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的水解用于n-ac-l-met生产。在这个过程中，将生产n-ac-l-met和d-met，它们可用作药物的非手性合成物或原料。但是，由于反应的对映体选择性差，n-ac-l-met的产率低，迄今为止没有开发出有效的解决方法。因此，我们提供了一种脂肪酶催化水解拆分n-ac-dl-metome来高效生产n-ac-l-metome的有效方法。酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。脂肪酶(lipase,ec3.1.1.3)全称为三酰基甘油酰基水解酶(triacyl-glycerolacylhydrolase)，是目前研究与工业化应用最多的一类水解酶。脂肪酶能催化酯水解、酯合成、醇解、酸解、酯酯交换和氨解反应。脂肪酶广泛存在于自然界的各种生物体，特别是在微生物和动植物组织中。动物脂肪酶主要存在于胰脏等器官组织，比如猪肝酯酶和猪胰脂肪酶，但由于动物脂肪酶活性较低、酶提取纯化成本较高和原料来源有限等因素，限制了其在工业中的应用。微生物脂肪酶来源丰富，种类繁多，不受季节气候等因素的影响，微生物生长产酶周期较短，而且具有耐有机溶剂、底物专一性强、催化选择性高和催化活性高等特点，因而微生物来源的脂肪酶有较高的工业化应用价值。目前市场上大部分商品化脂肪酶都通过细菌、真菌和酵母等微生物培养发酵获得。丹麦novonordisk公司、日本amano公司和美国genencor公司等主要酶制造商开发了多种的商品化酶制剂。这些酶制剂公司利用分子改造技术对微生物脂肪酶进行改造，提高酶活力、稳定性和立体选择性等酶学性质，以满足不同工业领域应用的需求。因而构建脂肪酶基因工程菌从而大量生产重组脂肪酶具有十分重要意义。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种立体选择性脂肪酶在生物法拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯中的应用，利用脂肪酶可以高效拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，得到高纯度n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯，提高产率。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种脂肪酶在拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯中的应用(如图2所示)，所述脂肪酶氨基酸序列如seqidno.1所示，编码基因的核苷酸序列为seqidno.2所示，具体的应用方法为：以含立体选择性脂肪酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冻干粉为催化剂，以n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯为底物，以ph7.0缓冲液为反应介质，在25-45℃、600-800rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯。所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/l，所述底物终浓度以缓冲液体积计为5-20g/l。进一步，优选反应时间为2-60min，更优选反应条件为35℃、800rpm反应10min。进一步，所述缓冲液为ph7.0，0.2mm的na2hpo4/nah2po4缓冲溶液。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含立体选择性脂肪酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌bl21)接种在lb培养基中，37℃培养od600至0.4-0.6(优选0.5)，加iptg至终浓度0.02mm，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用pbs缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到脂肪酶粗酶粉，即湿菌体冻干粉；所述lb培养基组成：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。进一步，本发明所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液用4mmhcl酸化至ph2.0，然后用等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相(优选分液漏斗分离出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，将有机相经纯水洗涤两次)，再经纯水洗涤两次，饱和nacl洗涤两次，将洗涤后得到的有机相用无水硫酸镁进行干燥，除去水后，再将有机相旋蒸至干，得到最终产物n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯。本发明立体选择性脂肪酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。mtinyheletshgriavresegegapllmihgnsssgavfapqlegeigkkwrvispdlpghgkssdaidpehsysmegyadamtevmqklgiadavvfgwslgghigiemiarypemrglmitgtppvareevgqgfksgpdmalagqevfserdvdsyarstcgepfeaslldivartdgrarrimfekfgngtggnqrdivaqaklpiavvngrdepfveldfvskvkfgnlwegkthvidnaghapfretpaifdrylmrflsdctig。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有seqidno.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还涉及所述立体选择性脂肪酶的编码基因，具体的，所述大肠杆菌密码子优化后的编码基因核苷酸序列如seqidno.2所示：ccatgggcatgaccatcaactatcacgaactggagacctctcatggtcgcattgccgtgcgcgaaagcgaaggtgaaggtgccccgctgctgatgattcatggcaacagcagcagcggtgccgtgtttgcaccgcagctggagggcgagatcggcaagaaatggcgtgtgattagcccggatttaccgggtcatggcaaaagcagcgatgccattgacccggaacatagctacagcatggaaggctatgccgatgccatgaccgaagtgatgcagaagctgggcattgccgatgccgtggtgtttggttggtctttaggcggtcatattggcatcgaaatgatcgcccgctatccggaaatgcgcggtttaatgattaccggtaccccgccggttgcccgtgaagaagttggccaaggttttaaaagcggcccggatatggcactggccggtcaagaagtgttcagcgagcgcgatgtggatagttatgcccgcagcacttgtggtgaaccgttcgaagcctctttactggatattgttgcacgcaccgatggtcgtgcacgccgcatcatgttcgaaaagtttggcaacggcaccggtggcaatcagcgtgacattgtggcccaagctaaactgccgatcgccgttgtgaatggtcgcgatgagccgtttgttgagctggacttcgtgagcaaggtgaagttcggcaatctgtgggagggcaagacccacgtgattgataatgccggtcatgccccgtttcgtgaaacaccggccattttcgatcgctatttaatgcgctttctgagcgattgcaccattggtctcgag。ag由于核苷酸序列的特殊性，任何seqidno.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。另外，可与seqidno：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与seqidno：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌和该工程菌。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种立体选择性脂肪酶，该脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，再利用重组大肠杆菌或重组脂肪酶为生物催化剂催化拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，可以生成n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯，对映体过量值>99％和转化率达到51.2％。目前常用l-甲硫氨酸合成方法为氨基酰化酶拆分法，利用氨基酰化酶催化n-乙酰-dl-甲硫氨酸立体选择性酰基水解反应获得l-甲硫氨酸，下游分离l-甲硫氨酸和n-乙酰-d-甲硫氨酸需要柱层析分离，分离成本高。本发明方法与氨基酰化酶拆分法相比较，分离更简单，通过溶剂萃取即可获得酶催化产物。本发明生物催化的手性合成反应具有条件温和、效率高，高度的化学选择性、区域选择性以及对映体选择性等优点，而且生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法。(四)附图说明图1为重组脂肪酶对映选择性水解拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的反应示意图；图2为有机合成n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的反应示意图；图3为n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯标样气相色谱图；图4为脂肪酶催化n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯水解反应10min的气相色谱图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。实施例1化学合成底物n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯取5gn-乙酰-dl-甲硫氨酸和5ml甲醇(分析纯，甲醇过量)放入250ml圆底烧瓶中，加入20ml甲苯作为反应溶剂，再加入125ul的浓硫酸(质量浓度98％)作为催化剂。通过油浴在磁力搅拌器80℃，600rpm条件下反应6-8h。反应结束后得到的反应液，先用饱和na2co3洗涤，除去其中的未反应酸，然后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，分液漏斗分离有机相和水相，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，再经纯水洗涤两次，饱和nacl洗涤两次，将洗涤后得到的有机相用无水硫酸镁进行干燥，除去水后，再将有机相旋蒸至干，得到较为纯净产物n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯(如图1所示)，得率80％。实施例2酶催化拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的脂肪酶筛选称取0.01g表1中筛选得到的不同来源具有脂肪酶水解活性蛋白的冻干的湿菌体菌粉于2mlep管中，加入1mlpb(ph7.0、0.2mm)作为反应溶剂，然后加入0.01g底物n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，以不加菌体为空白对照，置于35℃，800rpm恒温混匀仪中反应10min。反应结束后，反应液经2mmhcl酸化，再加入1ml乙酸乙酯，涡旋振荡器振荡2min，充分萃取，离心(1200rpm，3min)，得到有机相。取700μl乙酸乙酯层通过气相色谱检测菌体的立体选择性及酶催化水解活性，结果如表1所示，筛选得到底物的对映体过量值>99％和转化率达到51.2％的微生物菌株。最终选择源自噻吩苍白杆菌(ochrobactrumthiophenivorans，genbank:wp_094505884.1)的蛋白质序列，通过大肠杆菌表达系统密码子优化后获得基因序列seqidno.2所示核苷酸序列，编码蛋白氨基酸序列为seqidno.1所示。将该片段连接到pet28b载体上获得克隆载体pet28b-lip并将其转化于大肠杆菌escherichiacolibl21中，获得重组大肠杆菌，记为大肠杆菌bl21(f1)。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为819bp的开放阅读框(seqidno.2)。表1筛选具有水解活性的脂肪酶脂肪酶转化率(％)ee值(％)蛋白系列来源l156.60aspergillusoryzaeif04202l262.70aspergillusoryzaeif04202f151.2>99ochrobactrumthiophenivoransf21000rhodococcuserythropolisf31000ochrobactrumanthropia200aspergillusluchuensisa300penicilliumsubrubescensm100aspergillusflavusnrrl3357m263.50aspergillusoryzae3.042m400aspergillusoryzaerib40具体气相分析条件：采用agilent6890气相色谱仪，bgb-174手性毛细管色谱柱(30.0m×0.25mm×0.25um)，fid检测器；检测条件为柱温从初始温度100℃(恒温保持3min)升温至200℃(恒温保持2min)，升温速率5℃/min，进样温度250℃，检测器温度250℃，空气流量和氢气流量分别为300ml/min和40ml/min。载气为高纯n2，柱头压93.5kpa；尾吹气流量25.0ml·min-1；分流比50:1，进样体积为1ul。如gc的结果所示，n-乙酰基-l-甲硫氨酸甲酯和n-乙酰基-d-甲硫氨酸甲酯的保留时间分别为23.9min和24.0min(如图3所示)。实施例3脂肪酶蛋白诱导条件将实施例2获得的大肠杆菌bl21(f1)接种在lb培养基中，37℃培养od600至0.5(大概培养2h)，加iptg至终浓度0.02mm，30℃培养10-12h。300ml菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用pbs缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，10min，收集湿菌体。将收集的湿菌体用冻干机冻干得到脂肪酶f1粗酶粉，放于4℃冰箱保存。lb培养基组成：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl5g/l，溶剂为水，ph自然。实施例4不同脂肪酶催化n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯水解拆分的效果比较在ph7.0，0.2mm的na2hpo4/nah2po4缓冲溶液1ml中，加入终浓度10g/l的不同脂肪酶(实施例2制备的脂肪酶f1粗酶粉、novozym435、lipozymetlim、lipozymermim、lipasepsim)，0.01gn-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，于恒温混匀仪35℃，800rpm条件下反应10min，取反应液按实施例1方法检测n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值和转化率，结果见表2所示。结果显示，在35℃反应10min后，脂肪酶435、tlim、rmim和psim对底物都没有明显的水解拆分活性，而当脂肪酶f1催化反应时，产物n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的ee值>99％，转化率为51.2％(如图4所示)。表2不同脂肪酶催化n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的水解拆分效果比较实施例5反应时间对酶动力学水解拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的影响在ph7.0，0.2mm的na2hpo4/nah2po4缓冲溶液1ml中，加入终浓度10g/l的实施例3制备的脂肪酶f1粗酶粉，0.02gn-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，于恒温混匀仪35℃，800rpm条件下反应不同时间(2min～60min)，取反应液按实施例2方法检测n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值和转化率，结果见表3所示。结果表明，反应10min后，产物n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值已达到最高，对映体过量值>99％，转化率为51.2％，当反应时间大于10min，产物n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值基本不变，而转化率在增大。表3反应时间对酶催化反应的影响实施例6反应温度对酶动力学水解拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯的影响在ph7.0，0.2mm的na2hpo4/nah2po4缓冲溶液1ml中，加入终浓度10g/l的实施例3制备的脂肪酶f1粗酶粉，0.02gn-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，于恒温混匀仪不同温度(25-45℃)，800rpm条件下反应相同时间10min，取反应液按实施例2方法检测n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值和转化率，结果见表4所示。结果说明，在反应温度为35℃时，n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值最高，其ee值>99％。当反应温度高于35℃或者低于35℃时，n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的对映体过量值都会下降，说明温度对脂肪酶f1的光学选择性具有很大的影响。表4反应温度对反应的影响实施例7产物n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的分离提取在50ml圆底烧瓶中加入20mlph7.0，0.2mmpb缓冲溶液，称取0.2g实施例3制备的脂肪酶f1粗酶粉，再加入终浓度10g/l的n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯，用50mmnaoh进行流加滴定反应，控制反应ph维持在7.0，在磁力搅拌器35℃，600rpm条件下反应2h。反应结束后得到的反应液，用4mmhcl酸化ph至2.0，然后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，分液漏斗分离出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，将有机相经纯水洗涤两次，饱和nacl洗涤两次，将洗涤后得到的有机相用无水硫酸镁进行干燥，除去水后，再将有机相旋蒸至干，得到最终产物，并称重，产物n-乙酰-l-甲硫氨酸甲酯的收率达到92.3％，纯度100％。序列表<110>浙江工业大学<120>一种脂肪酶在拆分n-乙酰-dl-甲硫氨酸甲酯中的应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>272<212>prt<213>未知(unknown)<400>1metthrileasntyrhisgluleugluthrserhisglyargileala151015valargglusergluglygluglyalaproleuleumetilehisgly202530asnserserserglyalavalphealaproglnleugluglygluile354045glylyslystrpargvalileserproaspleuproglyhisglylys505560serseraspalaileaspprogluhissertyrsermetgluglytyr65707580alaaspalametthrgluvalmetglnlysleuglyilealaaspala859095valvalpheglytrpserleuglyglyhisileglyileglumetile100105110alaargtyrproglumetargglyleumetilethrglythrpropro115120125valalaargglugluvalglyglnglyphelysserglyproaspmet130135140alaleualaglyglngluvalphesergluargaspvalaspsertyr145150155160alaargserthrcysglyglupropheglualaserleuleuaspile165170175valalaargthraspglyargalaargargilemetpheglulysphe180185190glyasnglythrglyglyasnglnargaspilevalalaglnalalys195200205leuproilealavalvalasnglyargaspgluprophevalgluleu210215220aspphevalserlysvallyspheglyasnleutrpgluglylysthr225230235240hisvalileaspasnalaglyhisalaprophearggluthrproala245250255ilepheaspargtyrleumetargpheleuseraspcysthrilegly260265270<210>2<211>830<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ccatgggcatgaccatcaactatcacgaactggagacctctcatggtcgcattgccgtgc60gcgaaagcgaaggtgaaggtgccccgctgctgatgattcatggcaacagcagcagcggtg120ccgtgtttgcaccgcagctggagggcgagatcggcaagaaatggcgtgtgattagcccgg180atttaccgggtcatggcaaaagcagcgatgccattgacccggaacatagctacagcatgg240aaggctatgccgatgccatgaccgaagtgatgcagaagctgggcattgccgatgccgtgg300tgtttggttggtctttaggcggtcatattggcatcgaaatgatcgcccgctatccggaaa360tgcgcggtttaatgattaccggtaccccgccggttgcccgtgaagaagttggccaaggtt420ttaaaagcggcccggatatggcactggccggtcaagaagtgttcagcgagcgcgatgtgg480atagttatgcccgcagcacttgtggtgaaccgttcgaagcctctttactggatattgttg540cacgcaccgatggtcgtgcacgccgcatcatgttcgaaaagtttggcaacggcaccggtg600gcaatcagcgtgacattgtggcccaagctaaactgccgatcgccgttgtgaatggtcgcg660atgagccgtttgttgagctggacttcgtgagcaaggtgaagttcggcaatctgtgggagg720gcaagacccacgtgattgataatgccggtcatgccccgtttcgtgaaacaccggccattt780tc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