一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法与流程

本发明属于水产生物技术领域，尤其涉及一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

中华鳖(pelodiscussinensis)，俗称甲鱼、水鱼、团鱼，属于爬行纲、龟鳖目。其分布范围广泛，在我国除了青海、西藏和新疆外均有分布。由于中华鳖具有较高的营养价值和药用价值，一直以来深受广大消费者的喜爱。中华鳖雄性个体生长速度快于雌性个体，雄性个体的裙边宽厚，苗种的价格也较雌性高，养殖全雄或高雄性中华鳖可提高养殖产量，增加经济效益。因此，中华鳖的性别控制研究业已成为中华鳖育种的研究热点。

目前在中华鳖的性别控制研究方面，有温度诱导和外源激素诱导等方法，这些方法均可获得一定比例的性逆转个体。准确鉴定性逆转个体，并进行深入研究对于中华鳖性别控制和全雄苗种培育具有重要的意义。

性别特异性分子标记是一种中华鳖遗传性别鉴定简便易行的工具。在鱼类上已经开发出一些性别特异的rapd、ssr、aflp和snp等分子标记。随着测序技术的发展和费用的下降，利用基因组测序技术在鱼类性别特异性分子标记的开发方面也取得了一些良好的进展，获得了一些分子标记。为了筛查出性逆转个体，进而进行中华鳖性别控制技术研究，故发明一种可以用于中华鳖遗传性别鉴定的方法至关重要。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有常规技术主要通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，且在中华鳖规格较小或外形特征不明显时，无法进行准确鉴定，鉴定效果差。

如果未发生性逆转时，遗传性别与生理性别一致，但是如果是性逆转个体，遗传性别与生理性别不一致，无法通过生理性别的鉴定得到其遗传性别。

通常进行中华鳖性别控制研究中，中华鳖群体中同时存在未性逆转个体和性逆转个体，通过外形鉴定无法获得真正的遗传性别。

可以通过染色体鉴定的方法进行中华鳖遗传性别的鉴定，但是由于中华鳖没有特征明显的异型染色体，准确鉴定有一定的难度，同时染色体的鉴定耗时费力，成本较高。

解决上述技术问题的难度：

准确地进行中华鳖遗传性别的鉴定，可以通过开发准确高效的分子标记实现，目前虽然性别特异性标记开发的技术方法很多，一些技术手段也比较成熟，仅在技术方面而言不存在技术障碍，但是在实际分子标记开发过程中存在很大的不确定性，与研究人员使用的中华鳖群体、分子标记方法、研究过程中的分析方法、参数设置等方面都有密切的关系。

解决上述技术问题的意义：

性别特异性标记的开发，能实现早期对常规孵化苗种的遗传性别进行鉴定，从而进行单性苗种的培育和养殖，提高经济效益。在性别控制研究中，利用分子标记结合生理性别，准确鉴定出性逆转个体，对于开展中华鳖性别决定、性别诱导和性别控制技术研究，进行全雄(高雄)中华鳖选育具有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法。

本发明是这样实现的，一种中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法包括：

收集中华鳖雌雄个体进行rad测序，使用限制性内切酶ecori进行酶切；测序结果经过过滤和质控后，将所有的雌性样本和雄性样本比对基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果；

将10个样本总比对reads大于100，且在雄性样本中10个样本的比对总reads小于10的scaffold作为候选的雌性特有序列片段；

根据雌性特有序列片段进行雌性基因组walking，获得5967bp的dna片段seqidno：1；

基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物。

进一步，特异性引物为:

psff:gctgctgggaagacttagagttg；

psfr:cttgaatgtgactaggaaggcttc。

本发明的另一目的在于提供一种中华鳖雌性性别特异性分子标记，为5967bp的dna片段seqidno：1。

本发明的另一目的在于提供一种中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

1)采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；

2)提取中华鳖基因组dna，保存在超纯水中；

3)利用引物对psff/psfr在中华鳖个体中进行扩增；

psff:gctgctgggaagacttagagttg。

psfr:cttgaatgtgactaggaaggcttc。

4)扩增结果在1.5％-2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测；

5)进行遗传性别的鉴定。

进一步，步骤2)中，基因组dna提取方法包括：

(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经剪碎后放入1.5ml的离心管中；

(2)向离心管中加入10～15μl的蛋白酶k和500μl的hombuffer，55℃消化4～6h；

(3)加入500μl4.5mnacl溶液和300μl的氯仿，混匀20min以后，在13000rpm下离心10min；

(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μl无水异丙醇，摇匀20min，再13000rpm离心10min；

(5)弃上清液，加入500μl75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min；

(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥；

(7)加100μl超纯水溶解dna，4℃过夜；

(8)用1％的琼脂糖凝胶进行dna检测后，在-20℃下保存备用。

进一步，步骤3)中，性别特异性标记的扩增方法包括：

94℃预变性5min，35-40个循环(94℃变性40sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

进一步，步骤4)中，性别特异性片段的电泳方法包括：

扩增结束后，取2μlpcr扩增产物和2μl溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，120v电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果分析。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的用于中华鳖遗传性别鉴定的雌性特异性分子标记和鉴定方法，方法简单易行，操作方便，鉴定成功率高。

本发明对于遗传性别的鉴定不受规格和外形特征的限制，能准确鉴定；而现有技术对于规格较小，或外形特征不明显的中华鳖个体，不能准确鉴定。中华鳖苗种的早期性别鉴定，可以极大地提高养殖产量，增加养殖效益。

本发明不论是对于是否发生性逆转的个体均能准确鉴定，而常规技术只能通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，在不发生性逆转时获得遗传性别，而无法鉴定性逆转个体。

本发明可以实现一次性大批量准确鉴定中华鳖的遗传性别。

本发明对于中华鳖性别决定、性别控制和全雄苗种培育具有重要的科研价值。

附图说明

图1是本发明实施例提供的中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法流程图。

图2是本发明实施例提供的雌性特异性标记电泳结果图。

图3是本发明实施例提供的中华鳖雌性性别特异性分子标记鉴定方法流程图。

图4是本发明实施例提供的遗传性别鉴定电泳结果图。

图中：m为dl2000marker，f1-f12为雄性个体，m1-m12为雌性个体。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术主要通过对中华鳖外形进行生理性别的鉴定，不能进行遗传性别的鉴定。而且现有技术中，遗传性别鉴定的准确率低。

为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

本发明实施例提供的中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法包括：

s101:收集中华鳖雌雄个体各10只，进行rad测序(restriction-siteassociateddnasequence)，使用限制性内切酶ecori进行酶切。

s102:测序结果经过过滤和质控后，将所有的10个雌性样本和10个雄性样本比对基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果。

s103:将在10个雌性样本总比对reads大于100，同时满足在雄性样本中10个样本的比对总reads小于10的scaffold作为候选的雌性特有序列片段。

s104:根据雌性特有序列片段进行雌性基因组walking，获得5967bp的dna片段seqidno：1。

s105:基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物，电泳时在雌性个体中有特异性条带，在雄性中无条带。如图2。

如图3所示，本发明实施例提供的中华鳖遗传性别鉴定方法包括：

s201:采集中华鳖裙边组织，将其保存在无水乙醇中，带回实验室。

s202:提取中华鳖基因组dna，保存在超纯水中。

s203:利用引物对psff/psfr在中华鳖个体中进行扩增。

psff:gctgctgggaagacttagagttgseqidno：2。

psfr:cttgaatgtgactaggaaggcttcseqidno：3。

s204:扩增结果在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

s205:进行遗传性别的鉴定。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例

本发明中华鳖雌性性别特异性分子标记获取方法包括：

1)、收集中华鳖雌雄个体各10只，进行rad测序(restriction-siteassociateddnasequence)，使用限制性内切酶ecori进行酶切。

2)、测序结果经过过滤和质控后，将所有的10个雌性样本和10个雄性样本比对基因组，根据比对结果，过滤筛选在雌性样本中每个样本都有reads比对结果。

3)、将在10个雌性样本中总比对reads大于100，且在雄性样本中10个样本的比对总reads小于10的scaffold作为候选的雌性特有序列片段。

4)、根据雌性特有序列片段进行雌性基因组walking，获得5967bp的dna片段seqidno：1。

5)、基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物，电泳时在雌性个体中有特异性条带，在雄性中无条带。

其中，seqidno：1序列为：

catgtaagcattacagacttgttacctctcattagtgttcctgtgcatgacatcccttcctgtttaaatgctgtggccagctttagagaggaagtggtgagggggagaggcagtaaggcactgttgaagttcttattagctgtgcatatgagccactggtgaggctgaatttgtgctgagtcagcagagcaccttcctgttttcagaatccacagtagcacttcagctctgagttaatgagccttggttcacagggctgtggaggctaatgccagctagatctgaaaatcacaatgcccagctattaaaggggaataccaggaaatgagactgacttttttgaggacagaaatagctgtagaagtctgatgcaaagtgtaaaccttttgcttctccatccactcacaattatttaaaactaagaacttttgagaattgtagcggatgctttctacatgaaggtttttggacttcctgatgcatataatactgctgcagtaacagcttctcagagcactgaggacagattggaaaaatgtgggggcttgttactccccatattgaagattagcagagtagataccagcagtgttccttctaaactgcagggcagcacagcttcacaggtgattaatcagccccacccagacagtcagctccatgtacggagcctctgactgggcaggactgattaatcacctgtgaagctgtgctgtcactcatcttagagggaacactgattaccagcctgccccagaaccttccatgtacaagcaataaaaatttccagctttgcatgcaactggaggacatatttgcttttagcccctctgggacattgatggcaaagacttaaggaagaaatgaaaaagctgctccaacaccttgtattgtagtagagcaatggttcaaactttttggcctgtggcccatccagctcaatgcaaacctttctgcagactaccagctgctgatggaaatttgccgttaattatataattacgccagagccattttgctagtgctgcagctagggagaatggtttaatttaaccagtaagaaaggaaatattaagcagattatgtgctttaatttctcatgttagtttaccaaacttcattttaaatactgtaaaatattaatttatgttcaacacaaaaggcttcaacattgtctttatggcggggtggggaaccttttttgggttggggccactgacccacagaaaaatcagttggggaccacacaagcaagaagcaaaacccttcaaaaagccccagccctcactgatgtggtcccccaactgagacacctcactcccctgttgctccagcctcctctgcagtggaccgtattccctgtatagataataaaacaacaagattgtggagtcagaattttattgtcaagggagtgtctgatttgcttagaccaggggtgggcaaaagcctgtcagcgggccagatccagcctgcctagggctttgttccggcccacacggcagttccaggccccaccctctagcacgttgcctgggagccagggactcgcaagccctttcaactgcttccatttaaagtacttgtggctgacgggtaacagccccaaggaaggtgcaagccctttaaatacaggcagtccccgggttacgtacaagatagggactgtaggtttgttcttaagttgaatttgtatgtaagtcggaactggtacatattgtaggggaaactcgagccaaacatttctccagagctcagttttattctcccacacctcacttccctcagtcctttattctcaagctgaagtgtcttctgagaaaagccgcttcgcatctcctggtctgctgagaagccgctccgcgtctccctagtctgctggggggaagcagctagtgcggggttgcctcaccctgtttgtaagtagggatccgatgtaagtcggatccatgtaacccggggactgcctgtagaagcagttgaaagggctctagtgttccctgcttccaggcaatgcacaagcagtgaggctgggagcagtgagccctttaaatagcaggaattgaaagggctggccgctcttgtccctcactaactgcctgggagctaaatgggaggtgcaaaccctttcaactcctgccatttaaagctctgccccttctgtctgaggtcctgccccttctggggtggcctgtgaccacttcaaaaattattgcccacccctgacttagaccaagccattgggtagctaatgaaattacctggctataaaggttacagaagggtatggccaaacaaagcatgggtagggtgccaatacatgtcaacagaacagttaaaattgtaagttgttctagcagtgactatttggattgaggttaaagatataaaaaggggaaaaggcgatccttggctattgctatagaccaatactactacttgcagataaagatcgtctataggtagatgtcagtctgagagcatcttgttgtaataatagtgggtttgaagtgctgctgggaagacttagagttgcaatatgactgaactgagtggaattcagtaatagaaaatgggaagctgtagtcaagtcatctctgtatagaagcctaacatacttaagttatagaagctgaatatgactgtgatggggtggctaagccccgcactccagtggccccgaccctggctttatacggggaaagagggctgccgcacggtgtccctgctcagcgagggggggcggggctcggaacagtgggtgcgcaatgcccggcgctggggggaggggtggagtgtggggtcacatgcagatcgatgggacatttaaaccccacgtcggcgggaaggaaggggagctggatgtgccacggaggagaggaggacaagcagttccacaggcggtcgggaggagagactcctcagacccacggccccaacgtccgagacatcaccgggtaggaacaagcaggcggtgtcgtcgagtccatcggttgtgaggcgaggggggggggggggtaggaagtggcccagggcagggcatttctatagcccgcgggctggcgagtttcaggaggagccccctgccagccggacagggacacgattgaccctgcccttagggccctgggctgggacttgtgagtgagggtgggcccgggtccccctaccccctccctctactgattaaaaattctaatgtctggtgtgagtggaggggagcttcggaaagggtagggcgttggggcagagtgttcattttgtgcgattagtaaattggcaatcctatttccagtaggggaaccctactttggtgggcctcttgacagctgtcaaaaggagcttttctcttgtgaaccacctcctggttttttaaaattatacctattactttaaaagattagaaagaaaagaatggaagggagggattaaccttttctttgctttaatatattttttcgtaggaaaaatttttcgtttaccttttggttgctttcctgaacattggaactggacttgaggaacttaatttacaaaatgttcctaaatccttttttatggtccctgtaaaatgtgtgattttgttactgctcaagaaagattcaaatgctttccagttgattctcagaatggccacggctatgtgtttttgtttctactgatggtggacattcacacatgttttggggcgtgtaaaaaaatattttggaaaattttgtaaaaaaaggaaccttgggccctgtccctgtggtgtgaagggaactaatggggataagaaaatattctttaaaaaaaatatattgttgcgaagatgtttattaacatctttcctgatatagcttttcttgctaaatttcaagcttaaccggtatagtttcaaaaccaagagccgtccctttttataagaaaactcctgttagactttaggcccgagacaccgaacaagggggctgcaccctttaaccctgcttgggggtatttggatggtagggaatgcaaactttttacgttgacaagatataccttctgagtctccccttcattaaaacccctcttccatcatgtgcttgctctgtccccccccccttaaaaaaagaataatgcggtgactggacgaggagccagggggcgaaatggacccagggcgatgcaacacttacctatacatttggtgaagatgggcccagcagatgacccggaagccttcctagtcacattcaagagagtggcccgttggccggaagatcgttgagccactcttctcgccccctacctgactgggccagtccagtagtgaggcactgcactattacaaagtcaaggaagtgatcctggaccagatggggataaccgtggaaacttaccgacaacggttcaggcaggaacaatacccgcccggggcaagaccaagggcagtagtatagaaactccgggagacaggctggcggtggctagaactagatcagcggagtggggcacaggttgctgaactcgtggtgttggaacaattcctccagattttacccagtgggggacaacggtgggtgcgatggcatcacccatccactctctgaggcagttgccctcatggaagactacttgatggccgagtcagcggaaggagtaggaaagggggccagggaaaatccggtgccgaaaactgctttagaacggtcaagccgcccgagagacagcaacgagactggctgggcgaggccccaaggaagagggaacagctggagactggctccagtctggtcggggcccgttagggaagcaaggtctgaggaaacccccacctcccgaagagaaggaccggaacccagcgaggggtggcccgatcaagaacacctgtttcaggtgcagccaggagggtcatcttcaggaggagtgtgtgatgggatgaggtcacaggcgacccctcaggggtgcctcctggggtgctggcacggccactgccactcgccttcctgctctctggggctcctcacctcccggtcctgctgggccagctccctggtctcccccagccaaagccctgacctgaggtccctgcccccaccgagaagcagcacagacactgaacctcctcaggtccaaggagagtgcagtttagggcccagcctcctgagagagcactccccagatgggatcagaccccaaagaattaggtaagccccctttagcaatggaagggggaatgtgcacgctggttgccccccaggtaacaatcgcttactctgggtttgatagaaaataaaaatggttttgtgaagtggaagcagtaggatttaagtggtaataagtgaaagtaggcagagcaaagtaggtcacaaatcaaaagaaacaaaaccgcttggctaattctacattgaaacctcagtgcaaacttaaactcaccctaaaagctcttttccagctgccactctaaatcagggctgtcttccatgccctggggtctcaggctccttcctccaggtgcaacccagccaaaagccccaggcctctcctattctttttgttaaagaattgaggcccctccctaccaactacttctcagacttaaagacaaaagattgttgaacagtggctcatctagaagttgcagtaacaccctccatgtctcccattcatacatttgaaactcaccaagtattccccactccatgcgtctaattttccacatacaaatgatacatacaacagagtaagataaacagaaccaacagattgacatgaagattgatgggttacatgaaataattttctcaaaccacctttgagttatgtatattcaagtccgagagtctatttcataaagcagggggggtccgtcacagagtgtccttacatggactgtacattcgggcaggtattattggcagacgcagaccagaagctgcgggagggatggtggattgtcaaggcaattgaggtggaaggggtgccagtgattgctctggttga。

本发明实施例提供的中华鳖遗传性别的鉴定方法包括：

a)、待鉴定样本的收集：

根据中华鳖形态特征初步判断中华鳖的生理性别，雌性个体尾短，尾端不或很少自然伸出裙边外；雄性个体尾长，能够自然伸出裙边。采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为f，雄性记为m，带回实验室。

b)、基因组dna提取：

(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5ml的离心管中。

(2)向离心管中加入10～15μl的蛋白酶k和500μl的hombuffer，55℃消化4～6h。

(3)加入500μl4.5mnacl溶液和300μl的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min。

(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μl无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min。

(5)弃上清液，加入500μl75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min。

(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥。

(7)加100μl超纯水溶解dna，4℃过夜。

(8)用1％的琼脂糖凝胶进行dna检测后，在-20℃下保存备用。

c)、性别特异性标记的扩增：

(1)引物psff/psfr信息

psff:gctgctgggaagacttagagttg。

psfr:cttgaatgtgactaggaaggcttc。

(2)pcr反应体系:

(3)pcr反应过程:

94℃预变性5min，35-40个循环(94℃变性40sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

d)、性别特异性片段的电泳:扩增结束后，取2μlpcr扩增产物和2μl溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，在左边上样雌性个体(记为f1-f12)，右边上样雄性个体(记为m1-m12)，中间上样dl2000marker(记为m)，120v电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的观察。

e)、遗传性别的鉴定:

在1400bp左右有明显一条特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例

利用开发的雌性特异性分子标记快速批量进行中华鳖遗传性别的鉴定

a)待鉴定样本的收集：

随机收集3月龄的中华鳖个体，采用解剖的方法对其生理性别进行鉴定，选取其中雌性个体50个，记为f1-f50，雄性个体50个，记为m1-m50，并收集样本肌肉组织保存于无水乙醇中。

b)、基因组dna提取：

采用基因组dna试剂盒进行基因组dna的提取，方法按照说明书进行，提取后dna溶解于超纯水中保存于-20℃。

c)、性别特异性标记的扩增：

采用上游引物psff:gctgctgggaagacttagagttg，下游引物psfr:cttgaatgtgactaggaaggcttc的雌性特异性引物组进行pcr扩增。

pcr反应体系为10×pcrbuffermix2.5μl，10μm上下游引物各0.5μl，5u/μltaqdnapolymerase0.5μl，100ng/μldna模版1μl，超纯水20μl，总体积为25μl。

pcr反应程序为94℃预变性5min，35个循环(94℃变性40sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。

d)、性别特异性片段的电泳:扩增结束后，取2μlpcr扩增产物和2μl溴酚蓝混混匀后，在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，120v电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的观察。

e)、遗传性别的鉴定:

有明显的一条大小为1400bp左右特异性条带的为雌性中华鳖个体，未扩增出特异性条带的个体为雄性中华鳖。经鉴定，遗传性别与生理性别一致，雌雄个体均为50个，雌雄比例1:1。

如图4是本发明实施例提供的遗传性别鉴定电泳结果图。图中：m为dl2000marker，f1-f12为雄性个体，m1-m12为雌性个体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国水产科学研究院长江水产研究所

<120>一种中华鳖雌性性别特异性分子标记及遗传性别鉴定方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5967

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catgtaagcattacagacttgttacctctcattagtgttcctgtgcatgacatcccttcc60

tgtttaaatgctgtggccagctttagagaggaagtggtgagggggagaggcagtaaggca120

ctgttgaagttcttattagctgtgcatatgagccactggtgaggctgaatttgtgctgag180

tcagcagagcaccttcctgttttcagaatccacagtagcacttcagctctgagttaatga240

gccttggttcacagggctgtggaggctaatgccagctagatctgaaaatcacaatgccca300

gctattaaaggggaataccaggaaatgagactgacttttttgaggacagaaatagctgta360

gaagtctgatgcaaagtgtaaaccttttgcttctccatccactcacaattatttaaaact420

aagaacttttgagaattgtagcggatgctttctacatgaaggtttttggacttcctgatg480

catataatactgctgcagtaacagcttctcagagcactgaggacagattggaaaaatgtg540

ggggcttgttactccccatattgaagattagcagagtagataccagcagtgttccttcta600

aactgcagggcagcacagcttcacaggtgattaatcagccccacccagacagtcagctcc660

atgtacggagcctctgactgggcaggactgattaatcacctgtgaagctgtgctgtcact720

catcttagagggaacactgattaccagcctgccccagaaccttccatgtacaagcaataa780

aaatttccagctttgcatgcaactggaggacatatttgcttttagcccctctgggacatt840

gatggcaaagacttaaggaagaaatgaaaaagctgctccaacaccttgtattgtagtaga900

gcaatggttcaaactttttggcctgtggcccatccagctcaatgcaaacctttctgcaga960

ctaccagctgctgatggaaatttgccgttaattatataattacgccagagccattttgct1020

agtgctgcagctagggagaatggtttaatttaaccagtaagaaaggaaatattaagcaga1080

ttatgtgctttaatttctcatgttagtttaccaaacttcattttaaatactgtaaaatat1140

taatttatgttcaacacaaaaggcttcaacattgtctttatggcggggtggggaaccttt1200

tttgggttggggccactgacccacagaaaaatcagttggggaccacacaagcaagaagca1260

aaacccttcaaaaagccccagccctcactgatgtggtcccccaactgagacacctcactc1320

ccctgttgctccagcctcctctgcagtggaccgtattccctgtatagataataaaacaac1380

aagattgtggagtcagaattttattgtcaagggagtgtctgatttgcttagaccaggggt1440

gggcaaaagcctgtcagcgggccagatccagcctgcctagggctttgttccggcccacac1500

ggcagttccaggccccaccctctagcacgttgcctgggagccagggactcgcaagccctt1560

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catttctccagagctcagttttattctcccacacctcacttccctcagtcctttattctc1800

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ccgcgtctccctagtctgctggggggaagcagctagtgcggggttgcctcaccctgtttg1920

taagtagggatccgatgtaagtcggatccatgtaacccggggactgcctgtagaagcagt1980

tgaaagggctctagtgttccctgcttccaggcaatgcacaagcagtgaggctgggagcag2040

tgagccctttaaatagcaggaattgaaagggctggccgctcttgtccctcactaactgcc2100

tgggagctaaatgggaggtgcaaaccctttcaactcctgccatttaaagctctgcccctt2160

ctgtctgaggtcctgccccttctggggtggcctgtgaccacttcaaaaattattgcccac2220

ccctgacttagaccaagccattgggtagctaatgaaattacctggctataaaggttacag2280

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