本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法。
背景技术：
n-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的一种衍生物，是在葡萄糖二号的羟基被乙酰氨基取代的产物，在自然界中广泛存在。目前，国内关于n-乙酰氨基葡萄糖的获取方法主要有化学法和生物法两种，其中生物法是通过微生物发酵法合成n-乙酰氨基葡萄糖，其优点在于生产时间短，效率高，没有鱼腥味。但是发酵法合成n-乙酰氨基葡萄糖存在积累的氨基葡萄糖或n-乙酰氨基葡萄糖会被细胞从胞外转入胞内作为碳源利用使得发酵液中无法大量积累n-乙酰氨基葡萄糖。
公开号为cn104988196a的中国发明专利公开了一种n-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产方法，在发酵过程，当发酵液的残糖含量将至0.5g/l以下时，向发酵液中流加葡糖糖溶液，当发酵液的od660nm＝25～28时，加入iptg进行诱导，显著提高了发酵终点n-乙酰氨基葡萄糖含量和转化率，然而补加iptg诱导剂进行诱导表达外源蛋白有以下缺点：(1)iptg具有一定的毒性且价格昂贵。(2)iptg是通过过滤后溶解于无菌水中，在此过程中有染菌的风险不利于规模化生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，当od660nm大于或等于25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，将n-乙酰氨基葡萄糖产量提高至120g/l。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，发酵过程中，当发酵液的od660nm大于或等于25时，按照前5h以5ml/h流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束，所述半乳糖和l-天门冬氨酸的质量比为25:3。
本发明的有益效果在于：本发明在发酵培养过程中，当od660nm大于或等于25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，控制半乳糖和l-天门冬氨酸的浓度和比例，通过在半乳糖中添加l-天门冬氨酸使得glms与gfa1过量表达增加氨基葡萄糖的积累浓度，最后将n-乙酰氨基葡萄糖产量提高至120g/l。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明最关键的构思在于：在发酵培养过程中，当od660nm大于或等于25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，使得glms与gfa1过量表达增加氨基葡萄糖的积累浓度，最后将n-乙酰氨基葡萄糖产量提高至120g/l。
本发明提供一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，发酵过程中，当发酵液的od660nm大于或等于25时，按照前5h以5ml/h流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束，所述半乳糖和l-天门冬氨酸的质量比为25:3，即25g半乳糖和3gl-天门冬氨酸溶于300ml的水中，在高压灭菌锅中121℃灭菌25min。
在氨基葡萄糖发酵代谢途径中有乳糖启动因子，所以考虑用半乳糖替代iptg作为诱导剂诱导其外源蛋白表达。但是如果将半乳糖作为诱导剂一次性补加又会抑制其关键酶glms的反馈，通过采用流加的方式解决了这个难题。氨基葡萄糖合成酶为重要的限速酶分别由glms与gfa1编码。如果仅流加半乳糖对于氨基葡萄糖的积累又不如iptg的诱导，其原因是因为在糖酵解途径中氨基葡萄糖的积累一定浓度时会抑制glms与gfa1的表达，通过在半乳糖中添加l-天门冬氨酸使得glms与gfa1过量表达增加氨基葡萄糖的积累浓度，且其积累量超过了iptg的诱导的积累量。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明在发酵培养过程中，当od660nm大于或等于25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，控制半乳糖和l-天门冬氨酸的浓度和比例，通过在半乳糖中添加l-天门冬氨酸使得glms与gfa1过量表达增加氨基葡萄糖的积累浓度，最后将n-乙酰氨基葡萄糖产量提高至120g/l。
进一步的，当发酵液的od660nm为25～28时，按照前5h以5ml/h的流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束，所述半乳糖和l-天门冬氨酸的质量比为25:3。
进一步的，所述混合液的体积与发酵液的体积比为1:100。
进一步的，包括如下步骤：
将成熟的n-乙酰氨基葡萄糖种子液按照12～15％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵温度36-38℃，罐压0.03-0.05mpa，搅拌转速250-450rpm，通气比0.6-1.0v/v/m，溶氧25％～27％，ph＝6.8；
当发酵液的od660nm大于或等于25时，按照前5h以5ml/h流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束，所述半乳糖和l-天门冬氨酸的质量比为25:3，即25g半乳糖和3gl-天门冬氨酸溶于300ml的水中，在高压灭菌锅中121℃灭菌25min。
进一步的，所述成熟的n-乙酰氨基葡萄糖种子液的制备方法为：
配制种子培养基，控制温度36-38℃，罐压0.03-0.05mpa，搅拌转速300-400rpm，通气比1.0-1.2v/v/m，接入产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，培养周期为9～12h，ph下降至6.4～6.5，种子液的od660nm大于或等于1时视为种子成熟。
进一步的，所述种子培养基原料包括：
葡萄糖1.0％、硫酸铵0.18％、磷酸二氢钾0.9％、硫酸镁0.25％、稳定剂0.36％、和消泡剂0.1％。
进一步的，所述稳定剂为一水柠檬酸，所述消泡剂为有机硅。
进一步的，具体包括如下步骤：
配制种子培养基，控制温度36-38℃，罐压0.03-0.05mpa，搅拌转速300-400rpm，通气比1.0-1.2v/v/m，接入产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，培养周期为9～12h，ph下降至6.4～6.5，种子液的od660nm大于或等于1时视为种子成熟；
将成熟的n-乙酰氨基葡萄糖种子液按照12～15％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵温度36-38℃，罐压0.03-0.05mpa，搅拌转速250-450rpm，通气比0.6-1.0v/v/m，溶氧25％～27％，ph＝6.8；
所述发酵培养基原料包括：葡萄糖0.54％，硫酸铵0.35％，磷酸二氢钾1.0％，硫酸镁0.26％，稳定剂0.46％，消泡剂0.05％，氧化钙0.0046％和微量元素0.18％。
所述微量元素母液为七水硫酸铁5.00g/l、硼酸0.10g/l、六水氯化钴0.10g/l、一水硫酸锰0.33g/l、七水硫酸锌3.80g/l、二水钼酸钠0.10g/l，硫酸钴0.10g/l。
所述稳定剂为一水柠檬酸，消泡剂为有机硅。
进一步的，具体包括如下步骤：
配制种子培养基，控制温度36-38℃，罐压0.03-0.05mpa，搅拌转速300-400rpm，通气比1.0-1.2v/v/m，接入产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌进行培养，培养周期为9～12h，ph下降至6.4～6.5，种子液的od660nm大于或等于1时视为种子成熟；
将成熟的n-乙酰氨基葡萄糖种子液按照12～15％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵温度36-38℃，罐压0.03-0.05mpa，搅拌转速250-450rpm，通气比0.6-1.0v/v/m，溶氧25％～27％，ph＝6.8；
所述发酵培养基原料包括：葡萄糖0.54％，硫酸铵0.35％，磷酸二氢钾1.0％，硫酸镁0.26％，稳定剂0.46％，消泡剂0.05％，氧化钙0.0046％和微量元素0.18％；
所述微量元素为七水硫酸铁5.00g/l、硼酸0.10g/l、一水硫酸锰0.10g/l、七水硫酸锌3.80g/l、二水钼酸钠0.10g/l和硫酸钴0.10g/l的混合液；
当0.54％的葡萄糖耗至0.05％～0.06％时开始流加质量浓度为75％的葡萄糖，使培养过程中的残糖维持在0.01-0.08％；
当发酵液的od660nm大于或等于25时，按照前5h以5ml/h的流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束，所述半乳糖和l-天门冬氨酸的质量比为25:3，即25g半乳糖和3gl-天门冬氨酸溶于300ml的水中，在高压灭菌锅中121℃灭菌25min，所述混合液的体积与发酵液的体积比为1:100。
实施例1
将成熟的种子接到发酵罐中培养，移种量14％；全程发酵温度36℃，罐压0.03mpa，搅拌转速250rpm，通气比0.6v/v/m，培养过程中若溶氧低于25％则通过交替调节转速与风量使之维持在25％左右。35h后溶氧回升则逐步降低转速和风量；全程通过氨水将ph控制在6.8左右。培养过程中当od660nm＝25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸混合液。
所述的一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，种子培养基配方如下：
将b料在配料槽中溶解后打入发酵罐，消泡剂最后投入罐中。消前ph自然，消后用氨水调至7.0，再将分消的a料补进罐中。接种量4-5％。待ph降至6.4-6.5，od660nm＝1以上时视为种子成熟。
温度：36℃
罐压：0.03mpa
搅拌转速：300rpm
通气比：1.0v/v/m
培养周期9-12h，ph下降至6.4-6.5，od660nm＝1以上时视为种子成熟。将成熟的种子接种到发酵罐中，接种量14％。
所述的一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，发酵培养基配方如下：
将b料在配料槽中溶解后打入发酵罐中，消泡剂最后投入罐中，消前ph2.9，消后将分消好的a料补加到发酵罐中。
温度：36℃
罐压：0.03mpa
搅拌转速：250rpm
通气比：0.6v/v/m
ph：期间通过25％氨水将ph控制在6.7-6.8
补料1：当0.5％的初糖耗至0.05％左右(大约6h)开始流加消好的75％的葡萄糖使培养过程中的残糖维持在0.01-0.08％。
补料2：培养过程中当od660nm＝25以上时流加半乳糖和l-天门冬氨酸混合液。
发酵效价：120g/l
实施例2
将成熟的种子接到发酵罐中培养，移种量14％；全程发酵温度37℃，罐压0.04mpa，搅拌转速300rpm，通气比0.8v/v/m，培养过程中若溶氧低于25％则通过交替调节转速与风量使之维持在25％左右。35h后溶氧回升则逐步降低转速和风量；全程通过氨水将ph控制在6.8左右。培养过程中当od660nm＝27时流加半乳糖和l-天门冬氨酸混合液。
所述的一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的补料方法，种子培养基配方如下：
将b料在配料槽中溶解后打入发酵罐，消泡剂最后投入罐中。消前ph自然，消后用氨水调至7.0，再将分消的a料补进罐中。接种量4-5％。待ph降至6.4-6.5，od660nm＝1以上时视为种子成熟。
温度：37℃
罐压：0.04mpa
搅拌转速：350rpm
通气比：1.1v/v/m
培养周期9-12h，ph下降至6.4-6.5，od660nm＝1以上时视为种子成熟。将成熟的种子接种到发酵罐中，接种量12-15％。
所述的一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的补料方法，发酵培养基配方如下：
将b料在配料槽中溶解后打入发酵罐中，消泡剂最后投入罐中，消前ph2.9，消后将分消好的a料补加到发酵罐中。
温度：37℃
罐压：0.04mpa
搅拌转速：300rpm
通气比：0.8v/v/m
ph：期间通过25％氨水将ph控制在6.7-6.8
补料1：当0.5％的初糖耗至0.05％左右(大约6h)开始流加消好的75％的葡萄糖使培养过程中的残糖维持在0.01-0.08％。
补料2：培养过程中当od660nm＝27时流加半乳糖和l-天门冬氨酸混合液。
发酵效价：121g/l
实施例3
将成熟的种子接到发酵罐中培养；全程发酵温度38℃，罐压0.05mpa，搅拌转速450rpm，通气比1.0v/v/m，培养过程中若溶氧低于25％则通过交替调节转速与风量使之维持在25％左右。35h后溶氧回升则逐步降低转速和风量；全程通过氨水将ph控制在6.8左右。培养过程中当od660nm＝25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸混合液。
所述的一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的补料方法，种子培养基配方如下：
将b料在配料槽中溶解后打入发酵罐，消泡剂最后投入罐中。消前ph自然，消后用氨水调至7.0，再将分消的a料补进罐中。接种量4-5％。待ph降至6.4-6.5，od660＝1以上时视为种子成熟。
温度：38℃
罐压：0.05mpa
搅拌转速：400rpm
通气比：1.2v/v/m
培养周期9-12h，ph下降至6.4-6.5，od660nm＝1以上时视为种子成熟。将成熟的种子接种到发酵罐中，接种量12-15％。
所述的一种提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的补料方法，发酵培养基配方如下：
将b料在配料槽中溶解后打入发酵罐中，消泡剂最后投入罐中，消前ph2.9，消后将分消好的a料补加到发酵罐中，移种量12-15％。
温度：37℃
罐压：0.05mpa
搅拌转速：450rpm
通气比：1.0v/v/m
ph：期间通过25％氨水将ph控制在6.7-6.8
补料1：当0.5％的初糖耗至0.05％左右(大约6h)开始流加消好的75％的葡萄糖使培养过程中的残糖维持在0.01-0.08％。
补料2：培养过程中当od660nm＝25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸混合液。
发酵效价：120g/l
实施例4
发酵过程中，当发酵液的od660nm大于或等于25时，将25g半乳糖和3gl-天门冬氨酸溶于300ml的水中，在高压灭菌锅中121℃灭菌25min。按照前5h以5ml/h流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束。其氨基葡萄糖积累量约为120g/l。
对比例1
发酵过程中，一次性补加iptg(8g过滤后溶解在100ml无菌水中，在od660nm＝25-28时一次性补加到30l的发酵液中)其氨基葡萄糖积累量约为80-90g/l。
对比例2
发酵过程中，以半乳糖替代iptg即8g半乳糖于100ml水中用高压灭菌锅121℃灭菌25min，在od660nm＝25-28时一次性补加，其氨基葡萄糖积累量约为60g/l。
对比例3
发酵过程中，流加半乳糖未加l-天门冬氨酸，25g半乳糖溶于300ml水中用高压灭菌锅121℃灭菌25min，在od660nm＝25-28时按照前5h以5ml/h流加速度流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，之后以3ml/h的流速流加至发酵结束。其氨基葡萄糖积累量约为65g/l。
从实施例4和对比例1～3中可以看出，同时添加一定比例的半乳糖和l-天门冬氨酸，两者协同增效最后将n-乙酰氨基葡萄糖产量提高至120g/l。
综上所述，本发明提供的n-乙酰氨基葡萄糖产量的发酵方法，在发酵培养过程中，当od660nm大于或等于25时流加半乳糖和l-天门冬氨酸的混合液，控制半乳糖和l-天门冬氨酸的浓度和比例，通过在半乳糖中添加l-天门冬氨酸使得glms与gfa1过量表达增加氨基葡萄糖的积累浓度，最后将n-乙酰氨基葡萄糖产量提高至120g/l。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。