一种检测莴苣坏死黄化病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp试剂盒及其检测方法。

背景技术：

生菜(lactucasativa)属菊科莴苣种的叶用类型，别名鹅仔菜、莴仔菜，属一年生和二年生蔬菜，是具有很高营养价值的蔬菜之一，也是深受我国人民喜爱的蔬菜之一。近年来，生菜越来越受到人们的喜欢，特别是发现它的一些功效后，生菜的种植面积逐渐扩大，同时，种植户也面临着一系列病害问题，其中病毒病是比较常见的病害，分布广泛；露地种植危害重，发病率高达60%，甚至更高。

病毒侵染生菜后，破坏生菜的养分疏通通道，改变生菜器官或打乱组织代谢平衡，抑制光合作用。植株在幼苗期发病影响较大，主要表现出花叶斑驳状，同时叶片皱缩、歪扭，还有可能出现明脉，在严重的时候还会出现不规则灰褐色坏死斑；成株发病，叶片皱缩，叶面泡状突起很不平整，植株的生长受到抑制，出现明显的矮缩，甚至叶脉变成褐色或出现褐色坏死斑，严重影响着品质和产量。近年来，植物病毒侵染导致生菜大面积受害现象越来越严重，文献报道的感染生菜的主要病毒有马铃薯病毒属的马铃薯s病毒（potatoviruss,pvs）、马铃薯y病毒属的莴苣花叶病毒(lettucemosaicvirus,lmv)、蒲公英黄花叶病毒（dandelionyellowmosaicvirus,dymv）和黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus,cmv）等。

2018年，中国科学院寒区旱区环境与工程研究所植物病毒研究组在甘肃兰州地区的生菜田里发现了一种新的感染生菜的植物病毒-莴苣坏死黄化病毒（lettucenecroticyellowsvirus,lnyv）。lnyv为细胞质弹状病毒属的典型成员，病毒粒子呈弹状或多形状，经过固定后大多为杆菌状，长200-350nm，直径70-95nm，病毒核酸为单分子线形负义ssrna，长11-15kb，蛋白质包含5种结构蛋白，分别为蛋白l（分子质量160-180kda）、蛋白g（78kda）、蛋白n（57kda）、蛋白ns（38kda）和蛋白m（19kda）。lnyv的寄主限于藜科、菊科、豆科、百合科和茄科的一些植物，蚜虫是其主要的传播介体，lnyv早先在澳大利亚和新西兰有报道；此次在兰州生菜上检测到的lnyv为国内首次报道。

对于lnyv在我国生菜中分布、感病率以及对我国生菜的影响等基本信息，目前都不清楚。解决以上问题，急需开发一种特异、灵敏、实用且易于推广的分子检测技术。目前国际上针对lnyv的检测方法主要有酶联免疫吸附法（elisa）和逆转录聚合酶链式反应（rt-pcr），但这两种方法都存在一些缺陷。

elisa法的灵敏度不够高，易出现非特异性反应，还必须依赖酶标仪等专业设备；rt-pcr方法检测特异性强、灵敏度高、但与本发明相比，需要提取高质量的rna，操作复杂，所需试剂昂贵，对检测人员的技术水平要求高，除此之外，还必须依赖pcr仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备，推广普及受到很大限制。

相比之下，dna环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofdna,lamp)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上多个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的bstdna酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的dna片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在lamp反应过程中，从dntp析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。

与常规检测的pcr方法相比，lamp技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。

本发明将免疫捕获ic与lamp技术有机结合，成功建立了ic-rt-lamp技术特异检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的方法。

ic-rt-lamp结合了血清学和lamp两种方法的优点，不用提取rna，操作简便、特异性强、灵敏度达到了3.5pg/ml，比普通pcr高100倍，且检测成本低、不需要pcr仪等分子生物学仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合生菜等蔬菜病毒的检测，为lnyv的有效防治提供可靠的技术依据。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中莴苣坏死黄化病毒lnyv检测方法操作复杂、对操作人员技术水平要求高、所需仪器设备昂贵等问题，本发明的目的是提供一种莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp特异性检测引物组合物；本发明的另一目的是提供上述莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp检测试剂盒；本发明的另一目的是提供上述莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于特异性检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp检测引物组合物：由rt反向引物lnyv-r和lamp引物组组成，所述lamp引物组由正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、正向环引物lf和反向环引物lb组成；各引物序列具体如下：

lnyv-r：5’-ataccatgccgcgaatctgt-3’；

f3：5’-acctaagccagcaatgacat-3’；

b3：5’-tgcccaatccagcctctt-3’；

fip：5’-ctgttagatactcccgcctgcgacacctcctaacacctcctt-3’；

bip：5’-ctctggacgcaacccggaagattgcttcgtacctagccct-3’；

lf：5’-cgagcctagtaccttgatctgaag-3’；

lb：5’-aatttgttgactgagactgatgagg-3’。

所述的ic-rt-lamp检测引物组合物在检测莴苣坏死黄化病毒中的应用。

一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp试剂盒，包括lnyv抗体igg、rt反向引物lnyv-r、lamp引物组、第一链cdna合成试剂和lamp扩增反应试剂，其中特异性lamp引物组包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、正向环引物lf和反向环引物lb，上述特异性rt反向引物lnyv-r以及lamp引物组的序列如下：

lnyv-r：5’-ataccatgccgcgaatctgt-3’；

f3：5’-acctaagccagcaatgacat-3’；

b3：5’-tgcccaatccagcctctt-3’；

fip：5’-ctgttagatactcccgcctgcgacacctcctaacacctcctt-3’；

bip：5’-ctctggacgcaacccggaagattgcttcgtacctagccct-3’；

lf：5’-cgagcctagtaccttgatctgaag-3’；

lb：5’-aatttgttgactgagactgatgagg-3’。

除此之外，所述第一链cdna合成试剂由10mmdntps、5×m-mlv反应缓冲液、30u/μlrnase抑制剂、200u/μlm-mlv反转录酶和depc-h2o组成；所述lamp扩增反应试剂由10mmdntps、10×thermpopol反应缓冲液、100mmmgso4、8u/μlbstdnapolymerase和ddh2o组成。

本发明的试剂盒还包括lnyv抗体igg包被缓冲液（cb）、磷酸缓冲液（pbs）、磷酸洗涤缓冲液（pbst）、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。其中，所述抗体包被缓冲液cb为碳酸盐缓冲液，其浓度为0.05m，ph为9.6；所述磷酸缓冲液（pbs）和磷酸洗涤缓冲液（pbst）的浓度为0.02m，ph值为7.4；所述荧光染料检测液为1000×sybrgreeni；所述阴性对照品为ddh2o；所述阳性对照品为lnyv蛋白n基因标准品；所述阳性对照品序列如下：

生菜lnyv蛋白n基因标准品：

ctagggtcaggaacacagcgtatgatagtctagcaggagtgacgataggaaagagagcatcaaggaaatggtccgatgcagatatcaaaagtattcctatatatgatgtccatcaggtcccggctgctcaagtcattgctttagggaaagatctgctgacacagatccagaacaactccgtcaacactgtcacagtagactactgtttagtgttggcagtatctatacctaagcccgcaatgacatcttttgaacacctcctaacacctccttcttcagatcaaggtactaggctcgacttcacacaaccacaggcgggagtgtctaacagatcagggttgacggctatagaaaagaggactctggatgcaacccggaagaatttgttgactgagactgatgaggaaaagagggctaggtacgaagcaataattaaaaagatggaagaccaagaggctggattgggcacatcaaggactactgtggtaacctcggaaaccgaggcagcggcatacgggtttttggcggcaacattgctaaaactgtacgcgaaatcaactgagtcttatatagccgggcttgcccagataaggaacagattcgcggcatggtat。

所述的特异性检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp试剂盒在检测莴苣坏死黄化病毒中的应用。

一种特异性检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp检测方法：包括以下步骤：

步骤①抗体制备：表达并纯化lnyv蛋白n基因工程融合蛋白，用其免疫动物，获得特异性的lnyv抗体igg；

步骤②免疫捕获ic：将步骤①获得的特异性的lnyv抗体igg包被在反应容器中，捕获待测样品中的lnyv粒子；

步骤③反转录rt：以步骤②捕获的lnyv粒子为模板，利用lnyv的rt反向引物lnyv-r和第一链cdna合成试剂进行反转录rt反应获得第一链cdna；

步骤④lamp扩增：以步骤③得到的第一链cdna作为模板，用lamp特异性引物组和lamp扩增反应试剂进行lamp扩增；并以ddh2o作为阴性对照，以lnyv蛋白n基因标准品作为阳性对照；

步骤⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得lamp扩增反应产物判断待测样品中是否含有莴苣坏死黄化病毒。

其中：步骤①所述lnyv抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体，可以自制或从商业途径获得。

步骤④所述lamp扩增的反应体系（以反应体系12.5μl为例）如下：50ngcdna0.5μl、10×thermpopolbuffer1.25μl、100mmmgso40.75μl、10mmdntps1.75μl、10μmb3和f3primer各0.25μl、10μmfip和bipprimer各2.0μl、10μmlf和lbprimer各0.5μl、8u/μlbstdnapolymerase0.5μl、和ddh2o补至12.5μl。

步骤④所述lamp扩增的反应条件为：58-70℃恒温水浴中扩增60-100min，随后80℃变性10min，终止反应。

步骤⑤所述根据扩增结果判断病毒粒子是否为莴苣坏死黄化病毒的具体方法为荧光染料肉眼观察法或琼脂糖凝胶电泳检测技术。

其中荧光染料肉眼观察法为：取sybrgreeni荧光染料反应液加入步骤④所述lamp扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明sybrgreeni染料与双链dna结合，则为阳性反应，表示样品中含有lnyv；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含lnyv。

其中琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述lamp扩增的产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，若凝胶中存在明亮的弥散阶梯状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有lnyv；若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含lnyv。

本发明ic-rt-lamp方法的检测对象是完整的病毒粒子，通过固相化的特异抗体捕获特定的病原物抗原，再利用病原物基因组序列特异引物进行扩增，通过对扩增产物的检测和分析达到对完整病原物的检测。ic-rt-lamp检测方法将血清学方法和分子生物学方法有机地结合起来，特异性强，灵敏度达到了3.5pg/ml，比普通pcr高100倍，且无需提取rna，也不需要专业的仪器设备，简化了操作过程，降低了检测难度，提高了检测效率。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：

（1）操作方便：本发明提供的特异性检测莴苣坏死黄化病毒的ic-rt-lamp方法克服了现有技术中莴苣坏死黄化病毒的检测方法特异性差、灵敏度低，提取rna难度高、试剂昂贵，还需要热循环仪器等问题。本发明将血清学和lamp扩增技术有机地结合，充分发挥两种检测方法的优越性，直接以捕获的lnyv病毒粒子作为检测对象进行rt-lamp扩增，避免了rna抽提，降低了实验难度；

（2）准确性高：本发明利用高质量的lnyv抗体igg捕获待测样品中的lnyv粒子，提高了检测的特异性，减少了假阳性。lamp反应通过6条引物（f3、b3、fip、bip、lf、lb）特异性识别靶基因（lnyv蛋白n）的8个序列，特异性强，灵敏度比普通pcr高100倍；

（3）适用性好：本发明摆脱了对热循环仪器的依赖，lamp反应只需在恒温水浴中就可以发生，极大的扩展了该方法的使用范围。反应结束后可通过颜色变化用肉眼可以直接判断结果，使检测结果更直观，从而增加了检测的应用价值；

（4）本发明为生菜病毒病检测提供了新的技术平台，可用于莴苣坏死黄化病毒lnyv的快速检测，也能够用于监控lnyv病毒的发生、扩散和流行，非常适合在基层推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的特异性显色图；图中：1：阴性对照；2-7分别对应：lsv感病组织；cmv感病组织；lmov感病组织；armv感病组织；当归jhmv感病组织；7：生菜lnyv感病组织。

图2为本发明实施例电泳分析ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的特异性；图中：m：600bpmarker；1：阴性对照；2-7分别对应：lsv感病组织；cmv感病组织；lmov感病组织；armv感病组织；jhmv感病组织；7：生菜lnyv感病组织。

图3为本发明实施例莴苣坏死黄化病毒ic-rt-lamp反应温度优化试验结果的电泳检测图；图中：m：600bpmarker；1：阴性对照；2-8分别对应：56℃；58℃；60℃；62℃；65℃；68℃；70℃。

图4为本发明实施例莴苣坏死黄化病毒ic-rt-lamp反应时间优化试验结果的电泳检测图；图中：m：600bpmarker；1：阴性对照；2-6分别对应：20min；40min；60min；80min；100min。

图5为本发明实施例ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的灵敏性显色图；图中：1：阴性对照；2-7分别对应lnyv蛋白n基因标准品浓度：10^-1（3.5×10⁴ng/ml）；10^-3（3.5×10²ng/ml）；10^-5（3.5×10⁰ng/ml）；10^-7（3.5×10^-2ng/ml）；10^-8（3.5×10^-3ng/ml）；10^-9（3.5×10^-4ng/ml）。

图6为本发明实施例电泳分析ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的灵敏性；图中：m：600bpmarker；1：阴性对照；2-7分别对应lnyv蛋白n基因标准品浓度：10^-1（3.5×10⁴ng/ml）；10^-3（3.5×10²ng/ml）；10^-5（3.5×10⁰ng/ml）；10^-7（3.5×10^-2ng/ml）；10^-8（3.5×10^-3ng/ml）；10^-9（3.5×10^-4ng/ml）。

图7为本发明实施例电泳分析rt-pcr检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的灵敏性；图中：m：600bpmarker；1：阴性对照；2-7分别对应2-7分别对应lnyv蛋白n基因标准品浓度：原倍（3.5×10⁵ng/ml）；10^-1（3.5×10⁴ng/ml）；10^-3（3.5×10²ng/ml）；10^-5（3.5×10⁰ng/ml）；10^-6（3.5×10^-1ng/ml）；10^-7（3.5×10^-2ng/ml）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：阳性对照品的获得

1、总rna的提取

将50-100mg兰州地区感染lnyv的生菜叶片在液氮中研磨，用植物总rna提取试剂盒提取感病组织的总rna；

2、引物设计与合成

根据genbank上登录的生菜lnyv蛋白n基因序列（genbank登录号：aj746190.1）设计并合成了1对特异性正向（lnyv-f）和反向引物（lnyv-r）；其中上述引物序列如下：

lnyv-f：5’-ctagggtcaggaacacagcg-3’

lnyv-r：5’-ataccatgccgcgaatctgt-3’；

3、阳性对照品的制备

1）rt反应

利用生菜lnyv反向引物lnyv-r和m-mlv反转录酶进行rt反应，合成cdna第一链；

10μlrt反应体系如下:总rna2μl，10μmlnyv特异性反向引物lnyv-r1μl，depc-h2o3μl，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min；再加入5×m-mlvbuffer2μl，10mmdntps1μl，30u/μlrnase抑制剂0.34μl，200u/μlm-mlv反转录酶0.35μl和depc-h2o0.31μl；混合后42℃水浴1h，70℃保温15min，置冰上待用；

2）pcr反应

利用上述cdna第一链为模板，在extaqdna聚合酶作用下进行lnyv蛋白n基因的pcr扩增；

pcr反应体系为12.5μl，包括：50ngcdna0.5μl，5u/μlextaqdna聚合酶0.1μl，10×pcrbuffer1.25μl，2.5mmdntps1μl，10μm正向引物lnyv-f0.25μl，10μm反向引物lnyv-r0.25μl，和ddh2o9.15μl；

pcr扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，循环扩增35次，最后72℃延伸10min；

pcr产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，利用克隆载体试剂盒将目的片段连接在pmd18-t载体上，转化dh5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄lb培养基上，37℃摇菌12～16h；使用质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取2µl质粒，在与上述pcr反应体系相同的条件下进行pcr扩增；将pcr检测得到的阳性重组质粒测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为标准品，生菜lnyv蛋白n基因对应的片段长度分别为614bp；用nanodropnd-1000核酸/蛋白分析仪测定标准品的od260nm和od280nm值，根据od260nm和od280nm值计算质粒浓度；

4、结果：

经测序，上述设计的标准品与预期完全相符，回收的标准品片段序列如下：

生菜lnyv蛋白n基因标准品序列：

ctagggtcaggaacacagcgtatgatagtctagcaggagtgacgataggaaagagagcatcaaggaaatggtccgatgcagatatcaaaagtattcctatatatgatgtccatcaggtcccggctgctcaagtcattgctttagggaaagatctgctgacacagatccagaacaactccgtcaacactgtcacagtagactactgtttagtgttggcagtatctatacctaagcccgcaatgacatcttttgaacacctcctaacacctccttcttcagatcaaggtactaggctcgacttcacacaaccacaggcgggagtgtctaacagatcagggttgacggctatagaaaagaggactctggatgcaacccggaagaatttgttgactgagactgatgaggaaaagagggctaggtacgaagcaataattaaaaagatggaagaccaagaggctggattgggcacatcaaggactactgtggtaacctcggaaaccgaggcagcggcatacgggtttttggcggcaacattgctaaaactgtacgcgaaatcaactgagtcttatatagccgggcttgcccagataaggaacagattcgcggcatggtat。

实施例2：一种用于特异性检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的ic-rt-lamp检测试剂盒

该试剂盒由lnyv抗体igg、抗体包被缓冲液（cb）、磷酸缓冲液（pbs）、磷酸洗涤缓冲液（pbst）、rt反向引物lnyv-r、lamp引物组、第一链cdna合成试剂、lamp扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品组成，其中特异性lamp引物组包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip、反向内引物bip、正向环引物lf和反向环引物lb，上述特异性rt反向引物lnyv-r以及lamp引物组的序列如下：

lnyv-r：5’-ataccatgccgcgaatctgt-3’；

f3：5’-acctaagccagcaatgacat-3’；

b3：5’-tgcccaatccagcctctt-3’；

fip：5’-ctgttagatactcccgcctgcgacacctcctaacacctcctt-3’；

bip：5’-ctctggacgcaacccggaagattgcttcgtacctagccct-3’；

lf：5’-cgagcctagtaccttgatctgaag-3’；

lb：5’-aatttgttgactgagactgatgagg-3’；

第一链cdna合成试剂由10mmdntps、5×m-mlv反应缓冲液、30u/μlrnase抑制剂、200u/μlm-mlv反转录酶和depc-h2o组成；

lamp扩增反应试剂由10mmdntps、10×thermpopol反应缓冲液、100mmmgso4、8u/μlbstdnapolymerase和ddh2o组成；

抗体包被缓冲液cb为碳酸盐缓冲液，其浓度为0.05m，ph为9.6；所述磷酸缓冲液（pbs）和磷酸洗涤缓冲液（pbst）的浓度为0.02m，ph值为7.4；

所述荧光染料检测液为1000×sybrgreeni；所述阴性对照品为ddh2o；所述阳性对照品为生菜lnyv蛋白n基因标准品。

实施例3：免疫捕获ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv方法的建立

1、本发明中兔抗lnyv多克隆抗体igg的制备方法：

1）lnyv蛋白n基因融合蛋白的表达和纯化：从兰州地区感染了lnyv的生菜叶片中提取总rna进行逆转录聚合酶链式反应（rt－pcr），扩增lnyv的蛋白n基因片段。通过酶切克隆至pet-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌bl21，37℃培养，iptg诱导表达，镍柱亲和层析纯化获得大小为22.5kda的lnyv蛋白n基因融合蛋白；

2）多克隆抗体igg的制备：用1mg/ml的上述lnyv蛋白n基因的融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔；

初次免疫中，将蛋白抗原与弗氏完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；两周后进行加强免疫，将蛋白抗原与弗氏不完全佐剂等体积充分混匀，进行皮下多点注射；以后每两周加强免疫一次，在第4次加强免疫后的5～7d颈动脉采血，静至，离心，收集到的血清加入质量百分比浓度0.02%的叠氮钠，-20℃保存；所得抗血清依次通过20%、50%、33%三个饱和度的硫酸铵沉淀粗提后，透析至ph7.8的磷酸缓冲液，然后使用de52阴离子交换柱进行纯化而获得兔抗lnyv多克隆抗体igg；

2、免疫捕获ic：

1）取100mg感染lnyv的生菜叶片组织，加1mlpbs研磨后将研磨液转入1.5ml灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；

2）用0.05m，ph9.6的碳酸盐缓冲液将lnyv多克隆抗体igg稀释后混合，使lnyv抗体igg的终浓度为10μg/ml；取100μl上述稀释的lnyv多克隆抗体igg加入0.2mlpcr管中，37℃孵育2h；

3）弃去包被液，用pbst洗3次，每次3min;加入100μl上述感病组织粗提液，37℃孵育2h；

4）弃去感病组织粗提液，用pbst洗3次，ddh2o洗1次，短暂离心，吸去残液；

3、rt反应：

1)在上述免疫捕获pcr管中加入浓度为10μm的lnyv特异性反向引物lnyv-r1μl，depc-h2o4μl，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2min；

2））向上述pcr管中加入5×m-mlvbuffer2μl、10mmdntps1μl、30u/μlrnase抑制剂0.34μl、200u/μlm-mlv反转录酶0.35μl、depc-h2o补足至10μl，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15min，得到cdna第一链用于后续lamp扩增；

4、lamp扩增反应：

取一新的pcr管，按以下体系加入各试剂进行lamp扩增，反应体系为12.5μl，包括50ngcdna0.5μl、10×thermpopolbuffer1.25μl、100mmmgso40.75μl、10mmdntps1.75μl、10μmb3和f3primer各0.25μl、10μmfip和bipprimer各2.0μl、10μmlf和lbprimer各0.5μl、8u/μlbstdnapolymerase0.5μl、ddh2o2.25μl；并以ddh2o作为阴性对照，以生菜lnyv蛋白n基因标准品作为阳性对照；

lamp的反应条件为:58-70℃扩增60-100min,随后80℃变性10min，终止反应；

5、分析判断反应产物：

lamp反应结束后，在pcr管内侧加1μl1000×sybrgreeni荧光染料工作液，盖紧pcr管，上下颠倒混匀，采用肉眼直接观察pcr管内混合液的颜色变化：

若混合液颜色变为绿色，说明sybrgreeni染料与双链dna结合，则为阳性反应，表示样品中含有lnyv；

若混合液颜色为橙色，则为阴性反应，表示样品中不含lnyv；

或者，结果的观察也可以采用琼脂糖凝胶电泳检测技术：取5μllamp反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在1×tae缓冲液环境中，100v稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果：

若凝胶中存在明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有lnyv；

若凝胶中无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含lnyv。

实施例4：免疫捕获ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的特异性

为了分析免疫捕获ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的特异性，以感染百合、当归和生菜的6个主要病毒（百合隐症病毒-lsv、百合黄瓜花叶病毒-cmv、百合斑驳病毒-lmov、南芥菜花叶病毒-armv、日本金鱼藻花叶病毒-jhmv和莴苣坏死黄化病毒-lnyv）的感病叶片为样品，分别用lnyv多克隆抗体igg捕获病毒粒子，用上述实施例中的ic-rt-lamp检测体系进行反应。以健康生菜叶片为阴性对照，实验重复3次；

sybrgreeni荧光染料肉眼观察法结果显示，只有感染lnyv的生菜叶片的扩增产物出现绿色，其余感病叶片的扩增产物与健康生菜叶片的扩增产物均为橙色（图1）；琼脂糖凝胶电泳结果也证实，除了感染lnyv的生菜叶片能够扩增出弥散状核酸泳带外，其余样品均没有扩增出核酸泳带（图2）。这表明本发明建立的ic-rt-lamp方法对莴苣坏死黄化病毒lnyv有很高的特异性。

实施例5：免疫捕获ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的灵敏性

为了分析免疫捕获ic-rt-lamp检测莴苣坏死黄化病毒lnyv的灵敏性，

以上述实施例1中生菜lnyv蛋白n基因标准品为样品，经nanodropnd-1000核酸/蛋白分析仪测定其标准品浓度（3.5×10⁵ng/ml）后，再用depc-h2o对上述标准品进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各稀释液1.0μl作为模板，加入上述实施例中的lamp反应试剂进行lamp扩增，反应程序为65℃扩增100min；

作为对比检测，将上述10倍比稀释后的各稀释液利用上述实施例1中的pcr反应进行pcr扩增。pcr扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，循环扩增35次，最后72℃延伸10min；

lamp和pcr反应结束后，分别取5μl扩增产物上样，sybrgreeni荧光染料肉眼观察法和琼脂糖凝胶电泳结果显示lamp对生菜lnyv蛋白n基因标准品的反应灵敏度为3.5×10^-3ng/ml，即3.5pg/ml(图5-图6），pcr对生菜lnyv蛋白n基因标准品的反应的灵敏度为3.5×10^-1ng/ml，即350pg/ml(图7），可见免疫捕获ic-rt-lamp检测jhmv的灵敏性是普通pcr的100倍。

实施例6：生菜田间样品lnyv的免疫捕获ic-rt-lamp检测

取田间生菜叶片样品，用lnyv多克隆抗体igg捕获病毒粒子，再用上述实施例中的ic-rt-lamp检测体系进行rt反应合成cdna再进行lamp扩增；若荧光染料肉眼观察法显示橙色，或琼脂糖凝胶电泳扩增出弥散状核酸泳带，说明样品中含有莴苣坏死黄化病毒；若荧光染料肉眼观察法显示绿色，或琼脂糖凝胶电泳没有扩增出弥散状核酸泳带，说明样品中没有感染莴苣坏死黄化病毒。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包括一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110>中国科学院寒区旱区环境与工程研究所

<120>一种检测莴苣坏死黄化病毒的ic-rt-lamp试剂盒及其检测方法

<130>2019

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>生菜(lactucasativa)

<400>1

ataccatgccgcgaatctgt20

<210>2

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<213>生菜(lactucasativa)

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<210>3

<211>18

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<213>生菜(lactucasativa)

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<210>4

<211>42

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<213>生菜(lactucasativa)

<400>8

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