本发明涉及一种植物蛋白的提取加工方法，具体涉及一种脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽的制备方法。
背景技术：
桃仁（persicaesemen）为蔷薇科植物桃（prunuspersica(l.)batsch）或山桃（p.davidiana(carr.)franch.）的干燥成熟种子，产量较大，蛋白含量较高，是一种潜在的非常规蛋白质资源。植物蛋白质酶解后产生的多肽除了具有易被人体消化吸收的特性外，还具有很强的抗氧化、降低胆固醇、促进钙吸收等功能特性。但大部分蛋白质酶解后制得的多肽存在令人难以接受的苦味问题，桃仁蛋白多肽也概莫能外。此问题影响桃仁蛋白酶解肽的大众接受性，限制了桃仁蛋白酶解产物在食品中的应用。消除蛋白酶解产物中的苦味是多肽产品开发的关键。
蛋白质酶解后的苦味物质主要是疏水性氨基酸，多肽中的疏水基团与味蕾接触产生了苦味感。为了提高桃仁多肽的得率及其生物活性，实际生产中一般会采用各种方法提高桃仁蛋白质的水解度，这样导致多肽中疏水基团的暴露，从而产生大量苦味肽。常用的脱苦方法主要有选择吸附法、微生物发酵法、掩盖法、酶解法和分离法等。
cn02115912.2公开了一种无苦味大豆多肽粉的生产工艺中，提供了一种采用两级酶解工艺控制与高岭土和活性炭两组吸附剂相结合的方法来处理蛋白酶解产物中的苦味成分的方法，通过该方法处理的大豆多肽粉无苦味。
cn108294225a公开了一种酶解鱼蛋白多肽液脱苦脱腥方法中，应用微生物发酵方法对鱼蛋白多肽脱苦，通过将鱼蛋白酶解液与甘草提取液混合后，加入酵母发酵得到了良好的脱苦脱腥的效果。
cn108531531a公开了一种β-环糊精和壳聚糖脱苦的酪蛋白磷酸肽制备方法中，将两种包埋剂复合对酪蛋白磷酸肽包埋掩盖其苦味，也得到了良好效果。
cn107574211a公开了一种利用黑曲霉脱苦大豆肽的方法中，利用黑曲霉发酵产生的蛋白酶加入到大豆肽中，显著降低了大豆多肽的苦味。
付光中在《食品科学》2010年第19期发表的“虾头自溶产物苦味与蛋白平均疏水度的联系及脱苦”文章中提出，采用超滤法将虾头自溶产物分成不同组分，其中苦味主要来自分子质量为3000～5000d的多肽。上述方法是通过采用某种单一技术方法来降低蛋白酶解多肽中的苦味，虽然有较好的效果，但仍未彻底消除，而产品中只要带有少许苦味，消费者都将难以接受。因此如何彻底消除苦味是多肽食品加工的难题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种无苦涩味，口感好，桃仁蛋白品质高，食用后人体的吸收效果较好的脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）压榨脱油：将桃仁去壳剥皮后破碎，过筛，蒸炒，冷榨，得到桃仁饼粕；
（2）蛋白提取：将步骤（1）所得桃仁饼粕粉碎，过筛，按1︰15～20的料液比加去离子水混合形成悬浮液，调成碱性溶液后进行磁力搅拌，第一次离心，得到上清液；将上清液调成酸性溶液，第二次离心，得到沉淀物，冷冻干燥，得桃仁提取蛋白；
（3）蛋白酶解：将步骤（2）所得的桃仁提取蛋白加去离子水配制成4～5%的桃仁提取蛋白分散液，用嗜热菌蛋白酶对桃仁提取蛋白进行酶解，酶解完成后进行沸水浴加热灭活，得桃仁提取蛋白酶解液；
（4）超滤分离：将步骤（3）所得的桃仁提取蛋白酶解液进行超滤分离，通过与硫酸奎宁配制的标准苦味对比，得到分子量大于5000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分、分子量为3000～5000da高苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分、分子量为1000～3000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分和分子量小于1000da的低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分；
（5）类蛋白反应：将步骤（4）分离的分子量为3000～5000da高苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分加去离子水配制成质量浓度为35～40%的高苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液，用proteax蛋白酶进行类蛋白反应，反应完成后进行沸水浴加热灭活，得到分子量为3000～5000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液组分；
（6）离心沉淀：将步骤（5）所得的低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液组分按质量百分比加入10～12%的三氯乙酸，混合均匀后静置20～25min，低温离心，取上清液，得到分子量为3000～5000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液；
（7）组分混合：将步骤（6）所得的分子量为3000～5000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液与分子量大于5000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分、分子量为1000～3000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分和分子量小于1000da低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分混合均匀，形成混合桃仁提取蛋白酶解多肽液；
（8）接种发酵：将黑曲霉孢子悬浮液和米曲霉孢子悬浮液混合形成的混合发酵液按照多肽液质量的3～8%接种入步骤（7）所得混合桃仁提取蛋白酶解多肽液中在30～35℃条件下进行发酵处理48～72h，发酵结束后所得发酵液进行沸水浴加热灭活，经孔径0.20～0.80微米滤膜过滤，滤液即为脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽液；
（9）冷冻干燥：将步骤（8）所得脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽液置于真空冷冻干燥机内的冷冻干燥结束后所得粉末即为脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽成品。
进一步，步骤（1）中，所述过筛为过10目筛；所述蒸炒为在80～90℃的温度条件下翻炒10～15min；所述冷榨为采用双螺旋榨油机在温度为45～55℃榨油。
进一步，步骤（2）中，所述过筛为过100目筛；所述碱性溶液的ph为10～11；所述磁力搅拌于40～45℃条件下搅拌90～100min；所述第一次离心的条件是转速为10000～12000r/min，持续15～20min；所述酸性溶液的ph为5.0～5.5；所述第二次离心的条件是转速为12000～15000r/min，持续15～20min。
进一步，步骤（3）中，所述嗜热菌蛋白酶进行酶解的条件为：嗜热菌蛋白酶的酶活为50u/mg，加酶量为3500～4000u/g，溶液ph为6.5～7.0，酶解温度为40～45℃，时间为6～7h；所述沸水浴加热灭活的时间为20～30min。
进一步，步骤（6）中，所述低温离心的条件是离心速度为12000～15000r/min，离心时间为15～20min，温度为3～5℃。
进一步，步骤（8）中，所述黑曲霉孢子悬浮液和米曲霉孢子悬浮液混合发酵液由以下方法制成：分别将活化的黑曲霉和米曲霉孢子接种在斜面培养基上，在30～35℃条件下培养72～96h，然后用生理盐水分别将培养的黑曲霉和米曲霉孢子洗脱，接着将两种孢子洗脱液混合均匀形成悬浮液；在无菌操作台用纱布过滤悬浮液以除去悬浮液中的菌丝体，调节黑曲霉孢子悬浮液浓度为4×108～1×107cfu/ml，米曲霉孢子悬浮液浓度为1×107～2×106cfu/ml，将两者混合形成混合发酵液，置于3～4℃条件下保存备用。
进一步，步骤（8）中，所述米曲霉孢子为米曲霉cicc2014，黑曲霉孢子为黑曲霉cicc2106。
进一步，步骤（9）中，冷冻干燥时真空冷冻干燥机内的液面高度为1.5～2.0cm，在-20～-25℃下预冷20～24h，干燥时间为20～24h。
本发明的有益效果为：利用嗜热菌蛋白酶对桃仁蛋白进行酶解，一方面此酶在较高温度下仍具有酶解蛋白质的活性，另一方面嗜热菌蛋白酶能水解肽链氨基端疏水性氨基酸，脱去肽链上导致苦味的疏水性氨基酸，达到初步的脱苦目的；然后将桃仁蛋白酶解多肽液进行超滤分离，针对性的将其中苦味较重分子量为3000～5000d的多肽组分在特定proteax蛋白酶的作用下产生类蛋白反应，通过缩合或转肽作用富集疏水性氨基酸，生成不溶于水的疏水性类蛋白，再经浓缩后离心，去除苦味的疏水类蛋白，得到低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分；最后利用黑曲霉和米曲霉发酵分别能产生羧肽酶和氨肽酶的特点，进一步对混合低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分脱苦，最终得到几乎没有苦味的脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽粉末成品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例1
（1）压榨脱油：桃仁去壳剥皮后经破碎过10目筛，然后在85℃的温度条件下蒸炒15min，接着采用双螺旋榨油机进行冷榨，冷榨温度为50℃，压榨后得到桃仁饼粕；
（2）蛋白提取：将步骤（1）所得桃仁饼粕粉碎过100目筛，然后按1︰18的料液比与纯净水混合形成悬浮液，调节其ph至11，于45℃条件下磁力搅拌95min；接着将悬浮液置于12000r/min转速下离心15得到上清液；将上清液ph调节至5.5后用12000r/min的转速进行离心15min，得到沉淀物，然后将其冷冻干燥，得桃仁提取蛋白粉；
（3）蛋白酶解：将步骤（2）所得的桃仁提取蛋白粉加入去离子水配制成5%的桃仁蛋白分散液，调节ph值至7.0，然后按桃仁提取蛋白粉的质量比加入酶活为50u/mg的嗜热菌蛋白酶，加入量为4000u/g，维持45℃恒温6h，酶解完成后将其置于沸水浴中灭酶30min，得蛋白酶解液；
（4）超滤分离：将步骤（3）所得的酶解液进行超滤分离，超滤分离设备为msc300型杯式超滤系统，所用膜为截留分子量5000da、3000da和1000da的超滤膜，工作压力为0.25mpa，得到4种桃仁提取蛋白酶解多肽组分，分别是分子量大于5000da组分、分子量为3000～5000da组分、分子量为1000～3000da组分和分子量小于1000da的组分；
（5）类蛋白反应：将步骤（4）分离的分子量为3000～5000da桃仁提取蛋白酶解多肽组分配制成质量浓度为35%的桃仁提取蛋白酶解多肽组分溶液，调节ph至6.0，按桃仁提取蛋白酶解多肽质量百分比加入酶活为1.4u/mg的proteax蛋白酶，加入量为3000u/g，在40℃温度条件下保持70min，反应完成后于沸水浴中灭酶30min，得到低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分；
（6）离心沉淀：将步骤（5）所得的低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽组分按质量百分比加入12%的三氯乙酸，混合均匀后静置20min，然后采用冷冻离心机离心，离心速度为12000r/min，离心时间为20min，温度为5℃，取上清液，得到低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液；
（7）组分混合：将步骤（6）所制得的低苦味桃仁提取蛋白酶解多肽液与分子量大于5000da组分、分子量为1000～3000da组分和分子量小于1000da的组分混合均匀，形成各种分子量的混合桃仁提取蛋白酶解多肽；
（8）接种发酵：将黑曲霉cicc2106和米曲霉cicc2014孢子的混合发酵液接入步骤（7）所得的混合桃仁提取蛋白酶解多肽中，混合发酵液接入量为多肽液质量的5%，在35℃条件下发酵48h，发酵结束后将发酵液置于沸水浴加热灭活30min，经孔径0.80微米滤膜过滤，滤液即为脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽；
（9）冷冻干燥：将步骤（10）所得脱苦桃仁提取蛋白酶解多肽置于tf-fd-1型真空冷冻干燥机内的托盘中，液面高度为1.5cm，在-20℃下预冷24h，干燥时间为24h，干燥结束后所得粉末即为最终脱苦桃仁蛋白多肽冻干粉。
本实施例中的苦味评估：将实施例步骤（4）所得的酶解液4个桃仁提取蛋白酶解多肽组分的苦味进行评分，评分人员是随机挑选的15位年龄在20～40岁的味觉敏感的健康人员。通过与硫酸奎宁配制的标准苦味对比，根据不同处理组酶解液组分的苦味情况品尝后给予分值。苦味分值越低，苦味越小。15位评价员的平均感官评分显示分子量大于5000da组分是0.2分，分子量为3000～5000da组分是6.9分，分子量为1000～3000da组分是1.5分，分子量小于1000da的组分是1.2分；酶解液桃仁提取蛋白酶解多肽组分按上述实施例所述感官评分的平均分值结果见表1。
本实施例中黑曲霉cicc2106和米曲霉cicc2014孢子的混合发酵液的制备：分别将活化的黑曲霉cicc2106和米曲霉cicc2014孢子接种在斜面培养基上，在35℃条件下培养72h，然后用生理盐水分别将培养的黑曲霉和米曲霉孢子洗脱，接着将两种孢子洗脱液混合均匀形成悬浮液；在无菌操作台用纱布过滤悬浮液以除去悬浮液中的菌丝体，调节黑曲霉孢子悬浮液浓度为1×107cfu/ml，米曲霉孢子悬浮液浓度为2×106cfu/ml，将两者混合形成混合发酵液，置于3℃条件下保存备用。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于步骤（3）中所述嗜热菌蛋白酶的加入量为3500u/g，其桃仁提取蛋白酶解多肽组分按上述实施例所述感官评分的平均分值结果见表1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于步骤（5）中所述proteax蛋白酶的加入量为2000u/g，反应结束后其桃仁提取蛋白酶解多肽组分按上述实施例所述感官评分的平均分值结果见表2。
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于将步骤（3）中所述加入量为3500u/g嗜热菌蛋白酶替换为加入量为4000u/g的木瓜蛋白酶，其桃仁提取蛋白酶解多肽组分按上述实施例所述感官评分的平均分值结果见表1。
对比例2
对比例2与实施例1的区别仅在于将步骤（3）中所述加入量为3500u/g嗜热菌蛋白酶替换为加入量为4000u/g的中性蛋白酶，其桃仁提取蛋白酶解多肽组分按上述实施例所述感官评分的平均分值结果见表1。
对比例3
对比例3与实施例1的区别仅在于不进行步骤（5）所述类蛋白反应，其桃仁提取蛋白酶解多肽组分按上述实施例所述感官评分的平均分值结果见表2。
感官评分人员是随机挑选的15位年龄在20～40岁的味觉敏感的健康人员。以硫酸奎宁为苦味标准物，配制成0、1、3、5、7mg/l质量浓度的苦味标准液，苦味对应的分值分别为0分、1分、3分、5分、7分。通过与硫酸奎宁配制的标准苦味对比，根据不同处理组酶解液组分的苦味情况品尝后给予分值。苦味分值越低，苦味越小。
表1采用不同蛋白酶酶解对桃仁蛋白酶解液苦味评分分值的影响
注：表中数据右上角**表示实施例1和2的苦味分值与对比例1和对比例2相比存在极显著性差异，p＜0.01。
从表1可以看出，实施例1和2的苦味分值与对比例1和对比例2相比均存在极显著性差异，p＜0.01。感官评价分值结果表明采用3500u/g或4000u/g的嗜热菌蛋白酶酶解的桃仁提取蛋白酶解多肽的苦味均有显著降低，而无论是采用4000u/g的木瓜蛋白酶，还是4000u/g的中性蛋白酶，所得的桃仁提取蛋白酶解多肽均仍有较重的苦味。
表2不同处理对分子量为3000～5000da酶解多肽组分苦味评分分值的影响
注：表中数据右上角**表示实施例1和2的苦味分值与对比例1相比存在极显著性差异，p＜0.01。
从表2可以看出，实施例3和4的苦味分值与对比例3相比存在极显著性差异，p＜0.01。由感官评价分值结果可知，没有经过类蛋白反应的分子量为3000～5000da酶解多肽组分苦味分值较高，苦味较重，品尝评价后的苦味值为6.8，而应用3000u/g和2000u/g单位的proteax蛋白酶进行类蛋白反应后其苦味值有极显著的降低，苦味值分值分别只有0.6和1.3。