一种提高植物结瘤固氮效率的方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及大豆结瘤固氮方面的转基因技术及应用。

背景技术：

大豆是重要的粮油经济作物，是人类植物蛋白摄取的主要来源，因此大豆对氮素营养具有很高的需求，土壤中的氮营养往往不能够满足大豆对氮素的需求，过量施肥又会造成严重的环境污染。在长期的进化过程中大豆与根瘤菌形成互利共生的根瘤，在根瘤中将大气中的氮气还原成为植物可利用的氮元素，共生固氮提供了大豆生存所需的三分之二的氮，这一过程直接影响大豆的正常生长以及产量。因此，大豆结瘤和生物固氮一直是植物学中的重大研究课题，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。

近期研究表明，在大豆的结瘤固氮过程中mirna发挥着重要的调控作用。目前发现mir172、mir167、mir393均通过抑制其靶基因促进大豆根系结瘤及共生固氮（wangetal.,2014,2015;caietal.,2017）。已有的研究发现mir156通过调控其靶基因spl家族的转录因子，影响植物营养生长到生殖生长的过程(wangetal.,2009;wuetal.,2009)，过表达大豆的mir156也能够抑制大豆根瘤数量(yanetal.2013)，但mir156是具体通过哪个(些)靶基因如何调控根瘤发育，是否影响固氮效率却未见报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种基于大豆mir156b靶向基因的转基因植物培育方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种提高植物结瘤固氮效率的方法，在植物体内过表达序列表中的seqidno：1所示的基因，获得与正常植物相比根瘤数目增多、结瘤/固氮能力增强的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有seqidno：1所示基因片段的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增多、结瘤/固氮能力增强的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组表达载体为过表达重组表达载体。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组过表达载体以pezrk载体为骨架载体，并连接有35s强启动子。

作为本发明的一种优选技术方案，所述转化体利用所述过表达载体转化农杆菌k599制备。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。

本发明还包括seqidno：1所示基因的扩增引物对，其正向引物依次如序列表中seqidno：2所示；其反向引物依次如序列表中seqidno：3所示。

本发明还包括含有seqidno：1所示核苷酸序列的重组表达载体。

本发明还包括含有seqidno：1所示核苷酸序列的转化体。

本发明还包括采用上述方法所制备的转基因植物，尤其是转基因大豆。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

在发明人课题组前期的研究中发现，过表达大豆mir156b后，大豆的花期延迟(caoetal.2015)、产量性状得到了改良(sunetal.2018)，同时我们还发现根瘤数目明显减少，与之前的表型一致。通过在根瘤中对mir156b的靶基因检测发现gmspl9d的表达丰度最高，而且受mir156b抑制明显，因此我们推测gmspl9d可能是调控结瘤的主效靶基因。通过利用毛状根转化技术，我们发现过表达gmspl9d后大豆的结瘤明显增加，而且结瘤数目与gmspl9d的表达量呈正相关。因此该基因对于提高大豆结瘤和固氮效率具有很重要的应用价值。

参见下文的试验例，可见利用本发明构建转基因大豆，能够显著提高大豆的根瘤数目及其结瘤/固氮能力，一方面对于相关的理论研究领域具有一定的基础指导价值，同时在实际应用方面，对减少氮肥施用和提高大豆产量具有重大的实用意义。

附图说明

图1为gmspl9d基因响应根瘤菌处理的表达模式分析。在根瘤菌处理条件下(+r),gmspl9d明显受到诱导，并随着根瘤的发生发育，表达量逐渐增强。dai代表根瘤菌处理后的天数。

图2为gmspl9d过表达后对大豆结瘤能力的影响。(a)是被转化的空载对照(ev1)和过表达gmspl9d(35s:gmspl9d)整个根系及结瘤的状态；(b)是gmspl9d被成功过表达的单条根与ev1的比较；(c)过表达中gmspl9d表达量检测；(d)过表达gmspl9d的根瘤数目显著比对照增多。

图3为gmspl9d不同程度过表达后根瘤数目的比较。(a)不同转化事件(单条根)上结瘤的数目；(b)与(a)对应的根中gmspl9d的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置两次重复实验，结果取平均值。

本发明构建的过表达载体能够特异的过表达大豆中的gmspl9d基因。此基因定位在大豆19号染色体上，实时荧光定量pcr检测结果表明，gmspl9d基因在大豆根中的表达受到根瘤菌的诱导；随着根瘤的形成和发育gmspl9d逐渐升高。通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析显示，上调表达gmgmspl9d可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明gmspl9d基因在大豆根瘤形成和发育中具有重要的作用。

实施例1、gmspl9d基因响应根瘤菌处理的表达模式分析。

1）材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（简称w82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16h光/8h暗，光强7000lux，温度26℃，相对湿度为70%。播种后4天，子叶出土，接种根瘤菌，同时设置未接根瘤菌的对照(-r)。分别在接菌后0天、1天、3天、5天、7天后取根茎结合处往下1cm的主根和侧根样品，于液氮中冻存。

2）mrna的分离：采用trizol法提取大豆总rna，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2g加入1ml离心管中然后加入1mltripure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5min；②加200μl氯仿，振荡混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min，离心15min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；④弃上清，用75%的乙醇（depc处理过的无菌水配制）洗，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μl左右depc处理过的rnasefree水（depc水）溶解沉淀。

3）反转录为cdna：将提取的mrna用takara反转录试剂盒，反转录为cdna。

4）实时荧光定量pcr分析：采用tiangen公司的superrealpremixplus（sybrgreen）试剂盒，具体实验方法如下：在10μl体系中加入上步所得cdna模板0.2μl、正反向引物各0.2μl、2xsuperrealpremixplus5μl、ddh2o4.4μl；扩增程序为：95℃，15min；95℃，10sec；60℃，34sec，40cycles；65℃，5sec，95℃，5sec；其中：

正向引物为：ttcgtctgcttttgataatagtggc（seqidno：4）；

反向引物为：gatgatgtctctgagttgccattcc（seqidno：5）。

5）结果：如图1所示，随着根瘤菌处理后的时间的增加，gmspl9d基因的表达持续受到诱导，该结果说明gmspl9d基因是受根瘤菌诱导的，并可能在结瘤过程中发挥促进的作用。

实施例2、具有高结瘤固氮能力的转基因大豆的培育。

1）wilimas82大豆根组织中总rna的提取

研钵经180℃高温处理8h或经燃烧处理以消除rna酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、naac，均经1‰depc水处理过夜后121℃高温湿热灭菌30min，枪头，离心管65℃烘干备用；采用trizol法提取大豆总rna。

（1）取100mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1mltripure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5ml离心管，室温放置5min；

（2）加入200μl氯仿，震荡混匀，静置5min，4℃，12000r/min，离心10min；

（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；

（4）弃上清，用1ml75%的乙醇（depc处理过的无菌水配制）洗涤，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μl左右depc处理过的rnasefree水（depc水）溶解沉淀。

2）反转录pcr。

（1）在用depc处理过的的200μlpcr管中顺序加入5μlrna和3μloligo(dt)18；4μldntps，65℃温育5min后迅速置于冰上冷却；

（3）按以下顺序加入以下溶液：5xm-mlvbuffer（invitrogen公司出品）4μl，rnaseinhibitor1μl，m-mlv1μl，0.1mdtt2μl；

（4）将上述反应液混匀，37℃反应30min；

（5）反应结束后，70℃处理10min灭活逆转录酶活性；反应合成的cdna第一条链可用作pcr反应模板。

3）构建重组表达载体。

（1）gmspl9d基因片段的克隆。

根据gmspl9d的编码序列（seqidno：1）设计引物对用于过表达载体构建，根据载体pezrk上的多克隆位点，引物末端分别引入ecori和bamhi酶切识别位点；以大豆测序品种w82的cdna为模板进行pcr，扩增gmspl9d长为1080bp的基因片段（seqidno：1）；引物序列为：

正向引物：gaattcatggcttcagacgccaaac（seqidno:2）；

反向引物：ggatccttaaagtgaccaatgagcagattc（seqidno:3）。

扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃30sec，68℃1.5min，30个循环；68℃10min。

pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1080bp左右的条带。

回收的dna片段与blant3-t载体(takara公司)连接，5μl体系中加入tvector1μl，回收片段4μl，混匀混合液，25℃连接30min，热击法转入e.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

(2)重组表达载体的构建。

a.提取含有正确测序的gmspl9d1080bp基因序列的t载体质粒，用ecori和bamhi酶切获得核苷酸序列；

b.用ecori和bamhi酶切pezrk质粒，获得线状的pezrk核苷酸序列；

c.将gmspl9d核苷酸序列片段先克隆到pezrk载体中；

d.将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌dh5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，并在液体培养基中扩增并提取质粒。

4）农杆菌k599介导的毛状根转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：

a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl构建成功的质粒，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃（5min）融化后，加入800μllb（无抗性）液体培养基，28℃低速振荡(150r/min)3-4h；

c.4000r/min，30sec,去上清，加100μllb液体培养基，悬浮菌体后涂板含50mg/ml卡那霉素）；

d.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

（2）农杆菌k599介导的毛状根转化。

以大豆品种w82为材料，取种子材料用氯气消毒10h后，在b5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8g琼脂粉（sigma），1×gamborgb-5basal（phytotechnologylaboratories，货号：g398），ph调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌k599中侵染30min（od600=0.6）后，将外植体转至1/2ms培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉（sigma），0.5×murashige&skoogbasalmediomw/vitamins（phytotechnologylaboratories，货号：g519），ph调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2ms培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌usda110（od600=0.08）30ml/株，培养28天后统计根瘤数量。

5）结果观察。

结果如图2所示，表明在完全相同的实验环境下，上调表达gmspl9d的转基因根同空载体转化的转基因根系(ev1)相比，根瘤数量显著增多(图2b和2d)，图2c为对转基因根系中gmspl9d的表达水平分析，结果显示在转基因根系中gmspl9d的表达是显著上调。通过对单条转基因的根进行gmspl9d表达检测和根瘤统计发现，根瘤数目与gmspl9d的表达量呈正相关(图3)。

综上，发明人在课题研究中发现，过表达大豆mir156b后，大豆的花期延迟(caoetal.2015)、产量性状得到了改良(sunetal.2018)，同时我们还发现根瘤数目明显减少，与之前的表型一致。通过在根瘤中对mir156b的靶基因检测发现gmspl9d的表达丰度最高，而且受mir156b抑制明显，因此我们推测gmspl9d可能是调控结瘤的主效靶基因。通过利用毛状根转化技术，我们发现过表达gmspl9d后大豆的结瘤明显增加，而且结瘤数目与gmspl9d的表达量呈正相关。因此该基因对于提高大豆结瘤和固氮效率具有很重要的应用价值。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种提高植物结瘤固氮效率的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1080

<212>dna

<213>大豆属大豆(glycinemax)

<400>1

atggcttcagacgccaaactctcctcttctgagtccctcaacggtttgaaattcggccaa60

aaaatctattttgaggatgttggtcttgctactccagccacctctcttacttcttcttct120

tcttcttcttctgctgctactgttacttcttcttcttcttcaaggaaaggaagaggtggg180

tctgttcaaccagctcaacctcccaggtgtcaagttgaagggtgcaaagtagatctgagt240

gatgcaaaagcttactattctagacacaaggtctgtggcatgcactctaaatccccttca300

gtcattgttgctggtcttcaacaaaggttttgtcaacagtgtagcaggtttcatcagctt360

cctgagtttgatcaaggaaaaagaagttgccgtaggcgactagctggccataatgaacgt420

cggagaaagcccccaacaagctccctcttaacctctcgctatgccagactttcttcgtct480

gcttttgataatagtggcagaggtagcaactttctgatggaattgacttcatacccaaag540

cttagtctgagaaattcacttccaactcctagatcatctgagctagctcctggaaatcaa600

acctccacacttagctggaatggcaactcagagacatcatctgaccttttcttgcaaggt660

tcggtgggtgggacaagcttcgccagcccgggacatcctccaggggaaagttacattggg720

gtcaccgacacgagctgtgctctctctcttctgtcaaatcaaacatggggttctagaaac780

acagcaccaagtcttgggttgagtaacatgataaatttcaacgggacacccttgacacaa840

cttgctgcatcatctcatggtgcatcaatccatcaacttccaaatacctcgtggtttttc900

aagggcattgattctggtaactgttcgcccgaggtggtccctgatctaggtctcggtcag960

atttcacagcctctcaatagccaacttcatggtgagctggacctgtcccaacagggcagg1020

aggcattatatggatctagaacagtccagggcatatgaatctgctcattggtcactttaa1080

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaattcatggcttcagacgccaaac25

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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