一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素K2的方法与流程

本发明涉及一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素k2的方法，属于生物工程和发酵工程技术领域。

背景技术：

纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种可直接食用的益生菌，目前尚未发现毒副作用，被美国食品药品管理局(foodanddrugadministration，fda)认证为一般认为安全(generallyrecognizedassafe，gras)类微生物。中国食用纳豆的传统已有近千年历史，上世纪八十年代科学家们发现纳豆芽孢杆菌可以分泌一种高活力的纤溶酶——纳豆激酶，能够促进人体内血栓溶解。在进入二十一世纪后，科学家发现纳豆芽孢杆菌在分泌纳豆激酶的同时还能够分泌维生素k2。进一步的研究发现，维生素k2具有良好的促凝血作用。在纳豆芽孢杆菌培养的不同阶段，其能够合成不同的产物。

传统的纳豆芽孢杆菌培养会利用大量农副产品，如大豆粉、玉米粉，在培养过程中纳豆芽孢杆菌通过其分泌的纳豆激酶可以分解其中部分不溶的纤维蛋白变成可溶性蛋白并加以利用。传统的纳豆芽孢杆菌培养除了可以进行固体发酵，还可以进行液体的带渣发酵。随着发酵过程的进行，传统上难以利用的一些农副产品可以被分解利用。但是固体发酵存在着培养效率低下，场地占用大等问题，难以大规模推广，也无法形成产业优势。而液体发酵由于其中必须添加大豆粉、玉米粉等不溶性物质，在高温灭菌会进一步增加培养基黏度，导致培养过程中设备动力负荷大，培养结束的培养液处理难度大、成本高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素k2的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法，包括下列步骤：

步骤1：以pkd46质粒为模板，以up-ampr-f和ampr-down-r为引物，通过pcr获得包含有同源臂的重组片段；

up-ampr-f：

gttaaaacgtttcaggatttggccgtgacggggctgagccaggttgatccttaccaatgcttaat；

ampr-down-r：

gacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctcgcggaacccctatt；

步骤2：构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内，诱导同源重组；

步骤3：以氨苄青霉素作为筛选压力，挑选阳性克隆；

步骤4：以verify-f和verify-r为引物，通过pcr确定所述阳性克隆的真实性；

verify-f：tgccgggactcaggagcattt；

verify-r：tcgtgtcgctcgccggattt；

步骤5：以氨苄青霉素为培养压力，对阳性克隆进行驯化培养获得纳豆芽孢杆菌工程菌。

优选的技术方案为：步骤2的操作方法为电转导法或化学转导法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种发酵制备维生素k2的方法，包括下列步骤：

s1、将大豆粉或/和玉米粉分散于水中，制得质量百分比为5-10％的混合液，加热至95-105℃并维持20-30分钟，降温后加入淀粉酶、纤溶酶并保温20-40分钟，最后分离不溶物获得预处理的清液；

s2、将30～100g的蛋白胨、1-3g/的氯化钠、1-4g/l的k2hpo4和0.2-1.5g的mgso4，用s1步骤得到的预处理的清液溶解定容至1l，得到发酵培养基；

s3、按照质量百分比1％-5％的接种量将权利要求1或2制得的纳豆芽孢杆菌工程菌接种于所述发酵培养基，在发酵罐中进行发酵，获得维生素k2。

优选的技术方案为：所述发酵罐的罐体压力为0.02-0.05mpa，搅拌转速为250-750rpm，通气量为0.5-5vvm，培养温度为37℃，当溶氧回升至85％以上并维持不变后结束发酵。

优选的技术方案为：在s2步骤中，降温至80-90摄氏度加入淀粉酶，降温至35-45摄氏度加入纤溶酶。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

本发明以清夜进行发酵，具有生产效率高的优点。

附图说明

图1为pkd46质粒凝胶电泳图。

图2为同源重组片段凝胶电泳图。

图3为转化株凝胶电泳图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-图3。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素k2的方法

本实施例提供了一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法，并依据该改造的菌株在以大豆粉预处理液为主要成分的培养基中，下面再具体说明。

构建方法如下：

1)将购自湖南科爱医疗器械有限公司(优宝生物)的大肠杆菌dh5α-pkd46，在lb培养基中进行扩增培养，培养方法为普通lb培养基，于37℃，150rpm培养12h。然后用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的sanprep柱式质粒dna抽提试剂盒，并按照试剂盒内的说明书提供的方法获取pkd46质粒。

pkd46质粒提取成功的验证方法：用pkd46-p1/pkd46-p2引物pcr扩增，1％凝胶电泳确定是否提取成功。pcr条件为：pcr扩增体系为：1μlpkd46质粒，分别加入10μm的引物pkd46-p1、pkd46-p2各1μl，加入12.5μlpcrmix，加ddh2o补齐至25μl。

pcr扩增条件为：

凝胶电泳时在490bp处有明显条带时，则证明提取pkd46质粒成功。本实施例提取的pkd46质粒在490bp处有明显条带，如图1所示，因此可以证明提取pkd46质粒成功，用于本实施例的下列步骤。

2)将前述提取质粒作为模板，以up-ampr-f/ampr-down-r引物进行pcr扩增，获得同源重组片段，以1％凝胶电泳验证，并纯化回收，测定浓度为4.8ug/ml。pcr扩增体系为：1.5μl质粒，分别加入10μm的引物up-ampr-f、ampr-down-r各1μl，加入12.5μlpcrmix，加ddh2o补齐至25μl。pcr条件为：

凝胶电泳验证的标准为：凝胶电泳时在1066bp处有明显条带。本实施例获取的同源重组片段在1066bp处有明显条带，如图2所示，因此可以证明pcr扩增成功。

3)将自然分离获得的纳豆芽孢杆菌制备感受态，并用电转导法将前述同源重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内。通过浓度为100ug/ml的氨苄青霉素抗性平板筛选重组子。

所述的电转导法如下：

a.lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l。

gm培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l，山梨醇91.085g/l。

em培养基：山梨醇91.085g/l，甘露醇91.085g/l，甘油100g/l。

rm培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l，山梨醇91.085g/l，甘露醇69.225g/l。

b.挑取纳豆芽孢杆菌单菌落接种于lb培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量接种到gm培养基，37℃培养至od600为0.85-0.95。

c.将该gm培养基于冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，在4℃，5000rpm离心5min；用冰冷的em培养基洗四次，将培养液中的成分全部去除。

d.将沉淀悬于1/40体积冰冷的em培养基中获得感受态细胞，在80ul感受态细胞中加入1ul同源重组片段，转至预冷的2mm电转杯中，冰上放置5min。

e.以2500v/mm，4.8ms为电转条件进行电转，然后立即加入500ulrm培养基。

d.转移至无菌的1.5ml离心管中，37℃，100rpm，预培养3h后涂布到浓度为100ug/ml氨苄青霉素抗性平板上，37℃培养过夜。

4)将抗性平板上获得的菌落与原始菌落一起进行菌落pcr，pcr引物为verify-f/verify-r，以1％凝胶电泳验证，所获得的转化株条带比原始菌少508bp，如图3所示。pcr条件为：

pcr扩增体系为：1ul培养菌液，分别加入10μm的引物verify-f、verify-r各1μl，加入12.5μlpcrmix，加ddh2o补齐至25μl。

5)将获得的重组菌株在摇瓶中扩大培养，获得200ml摇瓶种子。装液量为50ml/500ml摇瓶，接种量为2.5ml，葡萄糖10g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l用水溶解后调整ph为7.0～7.4，氨苄青霉素浓度为50ug/ml，摇床转速为200rpm，37℃培养12h。

6)将摇瓶培养获得的种子液接种于5l种子罐中，获得一级种子。所用发酵罐装液量为4l，接种量为200ml，培养基成分为：葡萄糖5g/l，蛋白胨15g/l，nacl4g/l，k2hpo41g/l，溶解于预处理清液中。转速为200rpm，通气为0.5vvm，压力为0.02mpa，培养20h。

7)将部分一级种子接种于30l发酵罐中，进行清液发酵。装液量为24l，接种量为1.2l。

其中发酵培养基成分为：50g/l蛋白胨，2g/l氯化钠，2g/lk2hpo4，0.5g/lmgso4，用预处理清液溶解，发酵培养基初始ph＝5.3。

清液发酵的培养条件为：罐体压力为0.03mpa，搅拌转速为300rpm，培养温度为37℃，培养过程中逐步提高通气量，具体为：0-12h，q＝0.5vvm；12-24h，q＝1vvm；24-48h，q＝1.5vvm；48h至发酵结束，q＝2vvm。

发酵120h结束发酵，最终获得的发酵液中维生素k2浓度为85mg/l。

实施例2：一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素k2的方法

与实施例1不同之处在于：用化学转导法将同源重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内。

lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l。

10x盐溶液：k2hpo4140g/l，kh2po460g/l，(nh4)2so420g/l，二水合柠檬酸三钠10g/l，mgso4·7h2o2g/l。

gmi培养基(100ml)：10x盐溶液10ml，20％葡萄糖2.5ml，1％水解酪蛋白2ml，10％酵母粉1ml，蒸馏水定容至100ml。

gmii培养基(100ml)：10x盐溶液10ml，20％葡萄糖2.5ml，1％水解酪蛋白0.4ml，10％酵母粉0.5ml，0.1mcacl20.5ml，0.25mmgcl21ml。

1)挑取纳豆芽孢杆菌单菌落于3mllb培养基中，37℃过夜培养。

2)取1ml过夜培养物，接种于50mlgmi培养基中，37℃，200rpm震荡培养，当培养至对数期末期，快速取2ml接种于20ml的gmii培养基，37℃，100rpm震荡培养，培养1.5h。

3)加入200ul100xegta溶液，37℃，100rpm震荡10min。

4)取500ul培养物，向管中加入5ug同源重组片段(不超过5ul)，混匀，37℃，100rpm，震荡30min。

调整转速为250rpm继续培养1-2h。

实施例3：一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素k2的方法

一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法，包括下列步骤：

步骤1：以pkd46质粒为模板，以up-ampr-f和ampr-down-r为引物，通过pcr获得包含有同源臂的重组片段；

up-ampr-f：

gttaaaacgtttcaggatttggccgtgacggggctgagccaggttgatccttaccaatgcttaat；

ampr-down-r：

gacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctcgcggaacccctatt；

步骤2：构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内，诱导同源重组；

步骤3：以氨苄青霉素作为筛选压力，挑选阳性克隆；

步骤4：以verify-f和verify-r为引物，通过pcr确定所述阳性克隆的真实性；

verify-f：tgccgggactcaggagcattt；

verify-r：tcgtgtcgctcgccggattt；

步骤5：以氨苄青霉素为培养压力，对阳性克隆进行驯化培养获得纳豆芽孢杆菌工程菌。

优选的技术方案为：步骤2的操作方法为电转导法或化学转导法。

一种发酵制备维生素k2的方法，包括下列步骤：

s1、将大豆粉或/和玉米粉分散于水中，制得质量百分比为5％的混合液，加热至95℃并维持20分钟，降温后加入淀粉酶、纤溶酶并保温20分钟，最后分离不溶物获得预处理的清液；

s2、将30g的蛋白胨、1g/的氯化钠、1g/l的k2hpo4和0.2g的mgso4，用s1步骤得到的预处理的清液溶解定容至1l，得到发酵培养基；

s3、按照质量百分比1％的接种量将制得的纳豆芽孢杆菌工程菌接种于所述发酵培养基，在发酵罐中进行发酵，获得维生素k2。

所述发酵罐的罐体压力为0.02mpa，搅拌转速为250rpm，通气量为0.5vvm，培养温度为37℃，当溶氧回升至85％以上并维持不变后结束发酵。

在s2步骤中，降温至80摄氏度加入淀粉酶，降温至35摄氏度加入纤溶酶。

实施例4：一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法及其发酵制备维生素k2的方法

一种重组纳豆芽孢杆菌的构建方法，包括下列步骤：

步骤1：以pkd46质粒为模板，以up-ampr-f和ampr-down-r为引物，通过pcr获得包含有同源臂的重组片段；

up-ampr-f：

gttaaaacgtttcaggatttggccgtgacggggctgagccaggttgatccttaccaatgcttaat；

ampr-down-r：

gacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctcgcggaacccctatt；

步骤2：构建纳豆芽孢杆菌的感受态细胞，将步骤1获得的包含有同源臂的重组片段转导进入所述纳豆芽孢杆菌的感受态细胞内，诱导同源重组；

步骤3：以氨苄青霉素作为筛选压力，挑选阳性克隆；

步骤4：以verify-f和verify-r为引物，通过pcr确定所述阳性克隆的真实性；

verify-f：tgccgggactcaggagcattt；

verify-r：tcgtgtcgctcgccggattt；

步骤5：以氨苄青霉素为培养压力，对阳性克隆进行驯化培养获得纳豆芽孢杆菌工程菌。

步骤2的操作方法为电转导法或化学转导法。

一种发酵制备维生素k2的方法，包括下列步骤：

s1、将大豆粉或/和玉米粉分散于水中，制得质量百分比为10％的混合液，加热至105℃并维持30分钟，降温后加入淀粉酶、纤溶酶并保温40分钟，最后分离不溶物获得预处理的清液；

s2、将100g的蛋白胨、3g/的氯化钠、4g/l的k2hpo4和1.5g的mgso4，用s1步骤得到的预处理的清液溶解定容至1l，得到发酵培养基；

s3、按照质量百分比5％的接种量将制得的纳豆芽孢杆菌工程菌接种于所述发酵培养基，在发酵罐中进行发酵，获得维生素k2。

所述发酵罐的罐体压力为0.05mpa，搅拌转速为750rpm，通气量为5vvm，培养温度为37℃，当溶氧回升至85％以上并维持不变后结束发酵。

在s2步骤中，降温至90摄氏度加入淀粉酶，降温至45摄氏度加入纤溶酶。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

序列表

110中国科学院合肥物质科学研究院

120一种重组的毕赤酵母菌的构建方法及其应用

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