一种检测乳品中维生素B9含量的试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种检测乳品中维生素b9含量的试剂盒及其制备方法。

背景技术：

维生素b9(folicacid)，是一种水溶性维生素。由蝶呤啶、对氨基苯甲酸和l-谷氨酸组成的化合物，也叫蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，pga)，它是b族维生素的一种，人体本身不能合成。1941年，是米切尔(h.k.mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化并被命名为维生b9。研究表明，维生素b9缺乏易引起习惯性流产、胎儿畸形、无脑儿、死胎、早产、胚胎停育等非正常妊娠的产生。同时也与新生儿白血病等癌症，以及儿童智力低下有关。而摄入过量维生素b9会产出毒副作用，如神经受损、发育缓慢、降低食欲等，偶可见过敏反应。

由于维生素b9是目前很多食品中添加的重要的营养添加剂，因此维生素b9也越来越受到人们的重视，其相关研究领域正逐渐拓宽，因此食品中维生素b9浓度的检测会更加受到关注，其检测技术也会不断更新与发展。目前生物体、食品中维生素b9的测定多采用微生物法、比色法、同位素放射免疫法或色谱法、色-质联用法，但这些方法对于维生素b9的检测都有一定的局限性。

放射免疫法可用于检测和评价维生素b9的营养状况但不适用于检测单谷氨酸维生素b9衍生混合物。从定量检测的角度来讲，难以得到准确的维生素b9质量分数值。比色法一般用来测定原料维生素b9、纯酸制品或药品制剂中的维生素b9质量分数。气相色谱-质谱检测主要用于检测血清或红细胞中的维生素b9，但对检出限有一定的要求。微生物法是国际和国内普遍采用的方法，中国食品安全国家标准gb5009.211—2014也将生物法作为维生素b9检测的首选方法。是利用了微生物对某些维生素的特殊依赖性，通过观察微生物的生长繁殖速度来间接测定维生素的含量，同时微生物法具有较高的灵敏度，检测准确度高，先期投人少、检测成本低、见效快的优点但此法存在分析周期长，实验步骤稍烦琐的问题，传统微生物法先需将微生物孵育24h然后进行针刺接种后孵育24h，再处理样品、制备培养基和标准品，孵育24-48h，方可进行结果检测，检测周期5-6天。而且影响微生物法测定维生素b9的因素也较多，使用的营养缺陷型微生物，菌株活力存在差异均匀状态不好活力稳定性差并且在实验过程中使用的玻璃器具、样品称量、稀释的准确度、环境设施、检测结果受样品中所含抗维生素b9药物或抗生素成分等都会影响测定结果。甚至出现微生物为了适应不利环境易发生变异或重组，直接导致错误的结果。

因此，现有技术还有待进一步发展。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种检测乳品中维生素b9含量的试剂盒及其制备方法，以解决现有检测方法简单准确地检测乳品中维生素b9含量的问题。

本发明试剂盒制作过程如下：

1、含冻干菌的酶标板:costar板，包被物：维生素b9试剂盒所用的菌种是鼠李糖乳杆菌atcc7469菌株。菌悬液制备：

(1)番茄汁制备：将番茄去皮后用料理机打碎搅匀，纱布过滤，取干净的滤液备用。

(2)冷冻干燥保护剂配制：0.07g脱脂奶粉+1.2g蔗糖+0.1g谷氨酸钠(味精)+加无菌水至10ml，无菌过滤器过滤后用于稀释菌液。

(3)培养基配制：按说明配制细菌液体培养基和琼脂培养基(分别加番茄汁)，分装、按要求灭菌、倒平板、冷却备用。

(4)菌种复苏：atcc7469菌株菌液接50ul到细菌10ml液体培养基中，37℃温箱培养24小时。得到的菌悬液一部分用于传代和包被板孔，大部分用于菌种保存。

(5)细菌传代：将(4)培养的菌再转接50ul到相应的5ml液体培养基，37℃温箱培养16-20小时。

(6)平板传代保存：将(4)培养的细菌稀释一定倍数(100)后取100ul涂平板，37℃温箱培养2-3天，再冷藏保存，1个月传一次。

(7)菌种甘油保存：将(4)培养的菌悬液取部分加入等体积的50％的灭菌甘油，混匀后分装于冻存管，置-20℃保存。

(8)包被板孔菌悬液制备：将(4)培养的菌取5ml于离心管，4000r/min离心3-5min，弃上清，加入5ml无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5ml无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，再加入5ml无菌水4000r/min离心3-5min，弃上清，加入200ul无菌水溶解沉淀，混匀后再用冷冻干燥保护剂6稀释20倍，混匀，再用冷冻干燥保护剂6稀释50倍(总共1000)混匀，取该菌悬液120微升加入到微孔中酶标仪630nm测od值为0.2左右即可作为包被用的菌悬液。

冻干过程：

(1)将制备好的菌悬液1.5ul/孔加入到costar板微孔中，套上无菌袋，先置冰箱-20℃左右冷冻1小时；

(2)1小时后，置于冷冻抽干器上，关闭气阀，打开真空泵开关，同时关闭冷冻开关，抽0.5小时后关掉真空泵，打开气阀放气，再关闭气阀，打开真空泵抽1小时后关闭正空泵，打开气阀放气；

(3)将板放铝箔袋中，放入干燥剂，真空抽干，置冰箱冷藏保存。

标准品的制备：制备标准品所用高标品为d-维生素b9标准品96％，catno:100986lot:l880q91cas:95-30-3。

(1)标准溶解：先用0.01mol/l的naoh/乙醇溶液溶解稀释高标品到1100ppm，再继续稀释到550ppb浓度；

(2)取2.2ul550ppb标标准品于棕色玻璃瓶(容积大于2毫升)真空抽干15min,得到干燥的标准品，可长时间冷藏(最少半年)保存；每一盒提供3瓶；

(3)临使用时先加2毫升无菌水溶解并用细菌过滤器过滤得到约2毫升浓度为0.6ppb的标准品，足够稀释一次实验使用的标准曲线的用量，再按照说明书上的方法稀释成所需要的浓度(0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0ppb)后可直接使用

维生素b9测定培养基：海博牌维生素b9测定培养基lot：hb7020

(1)称培养基0.94g维生素b9测定培养基于干燥有缓冲液的培养基瓶，加入0.01g抗坏血酸；每一盒包含3瓶。

(2)使用时加10ml无菌水溶解后在95℃水浴5分钟；冷水或冰水浴迅速降温至室温；细菌过滤器过滤后可直接使用；

其中，试剂盒中包含无菌水：30ml/瓶，玻璃瓶装，经过灭菌的纯净水。包含粘合铂(封板模)：博奥通科科技有限公司提供。

本发明的检测试剂盒法只需处理样品、制备培养基和标准品孵育就可进行检测，检测周期3天。通过冷冻保护剂以及真空干燥方法降低了试剂盒中的菌种损失，提高维生素b9检测结果的准确性，并且试剂盒配备各浓度标准品，降低了实验误差，样品前处理可与其他维生素项目同时进行测定，每个试剂盒中还配备了质控物质利于实验质量监控，试剂盒稳定、重复高、回收率高。

附图说明

图1为本发明实施例中利用维生素b9标准品配置的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明试剂盒组成：96孔微孔板(包被菌种)1个、无菌蒸馏水(30ml)用于准备培养基和样品提取稀释液3瓶、维生素b9培养基(固态)3瓶、维生素b9标准品2瓶、封板膜2个、微孔板框1个。

本发明试剂盒可得相关参数：标准范围0、50、100、200、400、800ng/100g(ml)，回收率80-115％，检测底限0.0125μg/100g，板内cv值≤10％，板间cv值≤10％。

本试剂盒具体应用操作过程：

1.样品处理

1.1含添加维生素b9的液体样品(富含维生素的果汁饮品)

加入1ml样品至50ml无菌离心管中，准确加入样品提取液至40ml。然后摇匀，无菌过滤(或者在95℃水浴中提取30分钟，然后迅速冷却至30℃以下)，根据浓度范围，确定是否在1.5ml(或2.0ml)无菌试管中进一步稀释。

1.2含添加维生素b9的谷物，婴儿食品

称量1g(ml)均质样品至一个50ml无菌离心管中，加入样品提取液至40ml。在95℃水浴中提取30分钟，其间振荡至少5次，确保离心管塞紧闭。迅速冷却至30℃以下。然后离心，根据浓度范围，确定是否在1.5ml(或2.0ml)无菌试管中进一步稀释上清液。

1.3奶制品，谷物，婴儿食品和肉及肉制品的维生素b9总量(包括原生和添加的维生素b9)

提取复合物时，检测含原生维生素b9的样品必须先用酶化处理。使用酶的其他处理过程参考文献。提取过程如下：准确称取1g(ml)和20mg猪胰酶(谷物、蔬菜、水果、酵母、酵母制品以及肝脏推荐使用10mg鸡胰酶)均质样品至一个50ml离心管中，加入约30ml磷酸盐缓冲液(0.05mol/l；0.1％抗坏血酸盐；ph7.2，新鲜配制)，摇匀，加磷酸盐缓冲液至40ml。在37℃黑暗条件下孵育2小时(其间不时振荡)。谷物制品和肝脏孵育时间不少于12小时或者过夜处理。之后，在95℃水浴中提取30分钟。在提取时试管须振荡至少5次，并确保试管紧闭，迅速冷却至30℃以下。离心(大于8000g条件下离心5分钟)，根据浓度范围，确定是否在1.5ml(或2.0ml)无菌试管中进一步稀释上清液。

2.稀释倍数计算

根据产品上的标识浓度计算相应的稀释倍数。未知样品首先估算起浓度范围，可选择性进行多种稀释浓度的样品提取液进行分析。样品提取液必须当天使用，并在黑暗中保存。

样品提取时需要1g(ml)均质样品溶解于40ml蒸馏水或提取溶液中。这相当于样品的提取稀释倍数为40。这个稀释倍数已经包括在标准曲线中。在低浓度的维生素b9溶液中，样品使用量可高达5g(ml)。

样品提取液的稀释倍数计算示例：

固体样品，标注的维生素b9浓度为120μg/100g(由生产商在标签上标注)

提取液稀释应在标准曲线中间区域。因此，浓度应除以标准2。

计算：120μg÷0.1μg＝1200

→稀释倍数240(1：2400稀释)

稀释步骤：

1:40→0.1ml样品提取液+3.9ml试剂盒中的无菌水

1:30→0.1ml上述稀释液+2.9ml试剂盒中的无菌水

注：稀释过程必须充分混匀，吸取溶液应充分彻底。

3.检测步骤

注：试剂在使用之前要在室温下解冻1小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，

处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。

标准曲线配制：打开维生素b9标准品瓶，盖子朝上放置。使用0.2μm无菌滤膜过滤，得到标准品浓缩液。取6个无菌管(1.5-2.0ml)，并按照下列表1准备标准品溶液：

表1标准品制备配方表

3.1试剂准备

装有无菌水的瓶子：推开有色盖，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，丢弃。

标准品使用前，使用0.2μm无菌滤膜过滤，摇匀备用。

维生素b9培养基：足够进行至少6条微孔板条试验。

打开瓶盖用镊子取出干燥剂(丢掉干燥剂)。

加入10ml无菌水(取自试剂盒)至维生素b9培养基瓶中。

盖好培养基瓶，摇匀。

水浴加热该瓶至95℃保持5分钟，其间振荡至少2次，并确保瓶子封闭。

迅速冷却至室温(30℃以下)。

使用0.2μm无菌滤膜过滤培养基至15ml无菌离心管中。

3.2检测过程

微孔板实验中必须使用无菌水稀释的无菌样品，无菌水取自试剂盒。

取出需要数量的微孔板条并在板上固定，未使用的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，储存在2-8℃条件下。

移液器先移取培养基，之后标准品或稀释的样品，如下：

a.移取150μl维生素b9培养基至微孔中。

b.移取150μl标准品或稀释的样品至指定的微孔中

(用标准品或样品溶液冲洗移液器尖)。

c.用粘合箔盖住板条或微孔：除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手将粘合箔平压紧，使其充分封闭微孔板条。注意：保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分。

d.在37℃黑暗条件下孵育44-48小时。

3.3测量

再次压紧粘合箔，将微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中。

将微孔板翻回如前置于桌面上，从右上角开始以对角。

线方向180度角轻扯下粘合箔，与此同时务必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔与微孔板粘合过紧而在撕扯时带起微孔板。

破坏微孔中液体表面的所有泡沫(可以用移液管尖或针状物)。

用酶标仪610-630nm(或540-550nm)条件下读取混浊度。

孵育44-48小时后，微孔板在冰箱里最多能储存48小时，因此必须在这个时间段内测量混浊度。为了避免由于假期或周末所产生的时间上的损失，微孔板能在60小时之后进行评估计算。推荐使用定时器在44-48小时之后关闭孵育器。

4.结果计算

推荐在计算结果时使用结果分析专业软件。

判定检测结果有效：

od空白值<od标准1

od标准>0.6od

样品稀释倍数40已经包括在标准曲线中。在下面的公式中，只需要考虑提取的进一步稀释倍数和不同的样品重量。

以标准品吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立如图1所示的标准曲线。

从如图1所示的标准曲线上读取质控和样品的浓度值。

最终样品中维生素b9的浓度(μg/100g(ml))＝

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。