一种从猪肺中提取肝素钠的方法与流程

本发明属于肝素钠的提取技术领域，具体涉及一种从猪肺中提取肝素钠的方法。

背景技术：

肝素钠是带强负电荷的粘多糖，平均分子量为15000道尔顿，用于防治血栓形成或栓塞性疾病；各种弥漫性血管内凝血；也用于血液透析、体外循环、导管术、微血管手术等操作中及某些血液标本或器械的抗凝处理。肝素钠粗品是纯化肝素钠的原料，由猪、羊的小肠肠粘膜或牛肺提取而得。

肝素钠目前的主要来源是猪小肠，国际市场对肝素原料药的需求十分强劲。传统肝素钠从猪小肠中的提取制备方法，传统的肝素钠的酶解生产方法往往以猪小肠的肠粘膜为原料提取，肠衣常弃做它用，导致猪小肠无法有效利用，生产周期长，能耗大，收率低，生产一亿国际单位肝素钠粗品需2800-3000根猪小肠的粘膜，肝素钠的效价至多为80u/mg，并产生大量的肠渣和废水，污染环境。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种从猪肺中提取肝素钠的方法，扩大肝素钠的生产来源。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种从猪肺中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：

1)剔除猪肺样品的脂肪和主气管，清洗后，搅碎至糜状；

2)添加水和三梨酸钾并混合均匀，调节ph至9.0-9.2；

3)添加木瓜蛋白酶反应后，加入胰蛋白酶和过氧化氢反应得到酶解液；

4)用nacl调节ph至8.5，加热保温得到碱解液；

5)在45℃条件下用大孔径树脂保温吸附5h，加nacl溶液，滤去上层肺糜，在40℃条件下静置4小时，取出洗液。

6)加入复合蛋白沉淀剂，离心后吸取上清液，加入酒精静置24小时，吸取酒精和上清液；

7)将糊状沉淀放入恒温干燥箱50℃烘干即得肝素钠。

进一步的，步骤(2)中猪肺糜与水的重量比为1:1。

进一步的，步骤(3)中木瓜蛋白酶占浆液重量的0.1％，胰蛋白酶占浆液重量的0.05％，过氧化氢占浆液重量的1％。

进一步的，步骤(4)中加热至60℃保温一小时，得到碱解液。

进一步的，步骤(5)中大孔径树脂占浆液重量的2.5％。

进一步的，步骤(6)中复合蛋白沉淀剂由碳酸钙与氯化钙组成，复合蛋白沉淀剂占洗液重量的1％。

本发明的有益效果为：

本发明技术采用猪肺为原材料，有效利用了常被当做废物处理的猪肺，每生产一亿单位的肝素钠需2000副猪肺，肝素钠效价可达到110u/mg。较传统肝素钠酶解生产方法，本发明技术采取酶解和盐解共同作用的方式，使提取肝素钠效率更高，提取更全面。具体表现为：采用山梨酸钾作为防腐剂，防止在生产过程中，肝素随着时间逐渐分解从而降低生产出肝素的含量与效价；采用木瓜蛋白酶先酶解三小时再用胰酶酶解一小时的方式来进行酶解，较其他酶解方法，此方式酶解出的浆液肝素提取效果更好；降低采用多种蛋白沉淀剂共同作用来去除杂蛋白的方法，在相对温和的条件下进行杂蛋白的去除工作，有效避免了以往技术进行精制时采用的强酸强碱条件，防止过酸过碱降低肝素效价，同时也减少了废气与废水的产生，更加环保。整个工艺流程周期只需三天，生产周期短，能耗小，效率高，收率高，更环保。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供猪肺提取肝素钠粗品的制作方法，具体包括以下步骤：

1)选取新鲜猪肺或冰冻后自然解冻的猪肺，剔除脂肪，沿着肺管剔除肺内部的主气管。用清水简单冲洗剖面血污，放入绞肉机2-3次至猪肺呈糜状。

2)加入与猪肺糜重量比为1：1的水。加入浆液重量0.2％的山梨酸钾，搅拌充分，调节ph为9.0-9.2。

3)加入浆液重量0.1％的木瓜蛋白酶，充分混匀后反应3小时，再加入浆液重量0.05％的胰蛋白酶与1％过氧化氢，搅拌后反应一小时，得到酶解液。

4)加入浆液含量7％的nacl搅拌混匀调节ph至8.5，加热至60℃保温一小时，得到碱解液。

5)调节ph至8.5，在45℃条件下加入浆液重量2.5％的d208大孔径树脂保温吸附5小时。

6)加入3倍体积2mol/l的nacl溶液，用80目纱布滤去上层肺糜，取出树脂，加入肺糜重量10％的3mol/l的nacl溶液，在40℃条件下放置4小时，取出洗液，重复以上操作。

7)将两次洗液合并，四层纱布过滤至洗液清澈，加入洗液重量1％复合蛋白沉淀剂(碳酸钙与氯化钙)，8000r/min，离心5min，吸取上清液在清液中加入清液同体积80％酒精，混匀，静置24小时，吸取酒精和上清液。加沉淀5倍体积80％的酒精至沉淀中，搅拌浑浊静置至澄清，吸取上清液，重复3次。

8)将糊状沉淀放入恒温干燥箱50℃烘干，完成。

实施例2

本实施例提供了具体的肝素钠提取过程，具体包括以下步骤：

1)取新鲜或冰冻后自然解冻的猪肺1副，简单清洗，剔除大气管，用搅拌器搅碎成黄豆大小或更小的肉糜，得到500g猪肺糜，加入500ml蒸馏水，搅拌1-2分钟，充分混匀。加入1g防腐剂，防腐剂为山梨酸钾，搅拌混匀后，调节ph至9.0-9.2。

2)往浆液中加入0.5g木瓜蛋白酶，搅拌5-10分钟，酶解反应期间每隔1小时搅拌1次，每次搅拌5分钟，在25-30℃条件下充分反应3小时，得到第一次酶解液。往第一次酶解液中加入0.25g胰酶，搅拌5分钟。边缓慢搅拌边缓慢加入10ml过氧化氢，充分搅拌5分钟。在25-30℃条件下反应1小时，得到酶解液。

3)往酶解液中加入70g氯化钠，搅拌5分钟至氯化钠充分溶解，用氢氧化钠和盐酸调节ph为8.5，将浆液加热至60℃，保温1小时，得到盐解液。

4)使用氢氧化钠与盐酸再次调节ph到8.5,将浆液降温至45℃，加入25g进行了预处理的d208大孔径树脂，保温吸附5小时，吸附期间每隔2小时简单搅拌1分钟。

5)在吸附过后的浆液中，加入3000ml的1mol/l氯化钠简单搅拌1分钟，静置2分钟至树脂下沉猪肺漂浮，用80目滤袋或者纱布滤取漂浮的肺糜，用80目纱布或者滤袋过滤出树脂。

6)用200ml的0.5mol/l氯化钠简单冲去树脂上残留物，将树脂置入100ml的3mol/l的氯化钠溶液中，加热至40℃，保温洗脱4小时。用纱布滤出树脂，取出洗液，40℃保温放置。过滤出的树脂重复以上操作一次，再次保温洗脱4小时。

7)合并两次洗液，用4层纱布过滤至洗液清澈，加入2g复合蛋白沉淀剂，复合蛋白沉淀剂为1g碳酸钙和1g氯化钡，搅拌15-20分钟至蛋白沉淀剂溶解，静置后收集上清液200ml。

8)将收集的清液在8000r/min条件下离心5分钟，吸取上清液190ml，加入清液同体积的质量分数80％的酒精，摇晃至沉淀溶解，25-30℃条件下静置24小时，吸取上清液195ml。加入30ml的质量分数80％酒精至沉淀中，搅拌2分钟至浑浊，静置30分钟至澄清，再次吸取上清液，重复以上操作3次。

9)将糊状沉淀放入50℃恒温干燥箱烘干，肝素钠粗品完成，重量为0.30g，用羊血浆法检测出效价为110u/mg。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。