一种适用于Hi-C的小片段DNA文库构建方法与流程

本发明涉及基因测序领域，更具体地，涉及一种适用于hi-c的小片段dna文库构建方法。

背景技术：

高通量测序技术又称为下一代测序技术、以能一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定和读长较短等为标志。第二代高通量illumina测序平台具有测序通量高、准确度高和成本低等优点，并广泛应用于多个领域。

染色体构象捕获(chromosomeconformationcapture，3c)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3c技术衍生出来的hi-c则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在hi-c技术中，以整个细胞系为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质dna在空间位置上的关系；通过对染色质内全部dna相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。将通过第二代测序得到的dna序列对映射到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间接合频率的矩阵。利用这个频率矩阵，将基因组组装过程中形成的contig、scaffold进行染色体定位、方向没定位，延长拼接结果，辅助基因组组装，尤其对于获得群体困难无法构建遗传图谱的物种意义重大。

基于高通量进行染色体构象捕获的hi-c技术，是染色体相互作用研究领域的一个巨大的飞跃。但是距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远，hi-c交互数据包含相当高的随机噪声。同时，实验发现，现有hi-c高通量测序文库的构建也存在着信息丢失、捕获方法存在一定偏好性造成的获得的有效数据率不高的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于hi-c的小片段dna文库构建方法，该方法曾加生物素捕获步骤，可用于hi-c的小片段文库构建；同时该方法可显著减少非特异性扩增，明显改善dna纯度，对杂质较多的材料明显可提升其建库成功率。

本发明的第一个目的在于提出一种适用于hi-c的小片段dna文库构建方法，所述方法包括以下步骤：首先超声打断目标dna片段至主带集中在400bp，凝胶回收其中300-500bp的dna片段，对回收片段进行末端修复与加a获得末端修复后dna，对所述末端修复后的dna进行index连接获得连接物料，再对所述连接物料进行纯化获得dna纯化物料，最后将dna纯化物料进行pcr扩增获得dna测序文库。

进一步地，所述超声打断目标dna片段的操作为：

(1)取2μgdna样本纯化，溶于50μl去离子水中，使用qubit定量；

(2)取1μg纯化后的dna，使用去离子水补足体系至50μl；

(3)将50μl纯化后dna加入0.2mlpcr管中，并固定在浮漂上，超声波清洗仪水位加至最高并固定浮漂，打断功率为80w，时间为5min。

进一步地，所述末端修复与加a反应体系包括以下用量的各组分：片段dna50μl、nebnextultraiiendprepenzymemix3μl、nebnextultraiiendprepreactionbuffer3.0μl；反应体系20℃孵育30min，65℃灭活30min，4℃保温。

进一步地，所述index连接反应体系包括以下用量的各组分：末端修复后的dna60μl、nebnextultraiiligationmastermix30μl、nebnextligationenhancer1μl、ebnextadaptorforillumina2.5μl；反应体系混匀，20℃孵育15min后，加入3μluser酶，37℃孵育15min。

进一步地，所述pcr扩增体系包括以下用量的各组分：dna纯化物料20μl、nebnextultraiiq5mastermix25μl、indexprimer/i7primer2.5μl、universalpcrprimer/i5primer2.5μl；所述pcr程序为：98℃，30s；(98℃，10s；65℃，75s)6-12cycle；65℃，5min；降至4℃保存。

进一步地，所述方法还包括在pcr扩增后凝胶回收400-600bp文库片段来上机测序获得dna测序文库。

本发明的第二个目的是提出一种小片段dna文库，该文库由上述任一项所述的方法构建。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提出的一种适用于hi-c的小片段dna文库构建方法，对现有dna小片段文库构建实验技术进行了多项优化，使得文库构建成功率大大提升，成本显著降低，本发明的技术适用于绝大数物种；该方法操作流程简单，可以复制到其他具备分子生物学基础的其它实验室。

(2)本发明在现有dna小片段文库构建的基础上，曾加生物素捕获步骤，使该方法可用于hi-c小片段文库构建。

(3)本发明的方法利用超声波破碎的方式将基因组大片段打断至400bp左右，覆盖全基因组范围信息；在dna片段化后增加凝胶回收步骤，不仅进行了片段筛选，而且纯化了dna，对杂质较多的材料可显著提升其建库存成功率，对于物种的适应性大大增加。

(4)本发明的方法在末端修复之前进行凝胶回收，缩小目标片段范围至300-500bp，可显著减少非特异性扩增，有效提高有效数据率。

附图说明

图1为实施例1中末端修复之前进行片段筛选和不进行片段筛选两种情况，后续进行pcr扩增的结果示意图。

图2为本实施例1构建的钉螺hi-c的小片段dna文库的agilent2100大小检测图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

本实施例提供钉螺hi-c的小片段dna文库构建方法，所述方法包括以下步骤。

1.超声打断目标dna片段

1)取2μg左右dna样本进行纯化，溶于50μl去离子水中，使用qubit定量；

2)取1μg纯化后的dna，使用去离子水补足体系至50μl；

3)将50μl纯化后dna加入0.2mlpcr管中，并固定在浮漂上，超声波清洗仪水位加至最高并固定浮漂，打断功率选择最大，时间选择1-10min梯度摸索合适的打断条件；

4)打断后取2.5μl样品电泳检测打断效果，打断至主带集中在400bp的时间，即最佳打断时间；

5)打断条件摸索一次后即可适用于大多数纯化dna样本，无需多次摸索适合条件；最终确定的打断功率为80w，时间为5min。

2.目的片段回收

1)使用1.5×琼脂糖凝胶电泳与qiaquickgelextractionkit回收300-500bp大小的片段；

2)在紫外灯下小心地把大小约300-500bp的dna的片段切下来，并尽量去除多余的凝胶；

3)空离心管重称，切下的凝胶装在15ml离心管中并称重，算出凝胶重，1:1确定其体积，并加入3倍体积的bufferqg，常温摇晃10min；

4)待凝胶块彻底溶解后，观察混合溶液的颜色是不是黄色，若颜色为黄色，则继续下步操作，若为橙色，则加入100μl醋酸钠，使溶液恢复黄色再继续下步操作；

5)向溶液中加入一个胶体积的异丙醇并充分混匀；

6)将离心柱(qiaquickspincolumn)装在一个干净的2ml收集管中；

7)把5)中的溶液加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃掉废液，并把qiaquick离心柱重新套回2ml收集管中，若溶液体积大于700μl，则分数次加入，直至全部液体过柱；

8)在离心柱中加入0.5mlbufferqg12,000rpm离心1min，弃滤液；

9)在离心柱中加0.75mlbufferpe12,000rpm离心1min，弃滤液，在离心柱中再次加0.75mlbufferpe12,000rpm离心1min，弃滤液；

10)再次12,000rpm离心1min；

11)取出离心柱，把离心柱装在一个干净的1.5ml离心管上；

12)在吸附柱的中间部位加25μlbuffereb(10mmtris-hcl,ph,8.0)，温室放置3min，再次12,000rpm离心1min，取上清液，用于后续文库构建或-20℃保存备用。

3.目的片段的末端修复与接头连接

1)dna末端修复与加a

参照如下体系依次加入试剂

反应体系20℃孵育30min，65℃灭活30min，4℃保温。

2)接头连接

参照如下体系依次加入试剂：

混匀，20℃孵育15min后，加入3μluser酶，37℃孵育15min。

4.ampurexpbeads纯化

1)加dna溶液的1.5倍体积磁珠溶液到dna连接产物中；振荡数秒混匀，室温孵育5min；

2)瞬时离心，将离心管放在磁力架上静置2min，移去上清；

3)离心管保持在磁力架上，加入1ml的75％乙醇清洗磁珠，弃乙醇，重复此步骤一次；

4)打开管盖，室温风干30s；加入52μl去离子水，振荡将磁珠重新混悬，室温孵育5min；

5)瞬时离心，将离心管放到磁力架上静置1min，吸取50μl上清转移至新离心管中，若感觉吸到磁珠，可再用磁力架吸附一次，保证磁珠完全去除，文库可进行下步操作或保存于-20℃冰箱。

5.目标片段富集

1)配置streptaridinbeads结合液及洗涤液

2)涡旋磁珠，取10μl加入1.5mllobind离心管中；使用100μl1×twb(tweenwashingbuffer)清洗，室温震荡3min；磁力架吸附磁珠，弃上清；

3)再次使用100μl1×twb清洗磁珠，室温震荡3min；磁力架吸附磁珠，弃上清；

4)50μl2×bb(bindingbuffer)和50μlhi-cdna重悬磁珠；室温震荡15min；磁力架吸附磁珠2-3min，弃上清；

5)使用100μl1×twb清洗磁珠并转移至一新lobind离心管中；磁力架吸附磁珠，弃上清；

6)重复2次1×twb清洗磁珠；

7)加入25μl水，70℃温浴5min洗脱dna，磁力架吸附，回收上清；

8)加入20μl水，70℃温浴5min洗脱dna，磁力架吸附，回收上清；

9)总体积45μl，4μl用于跑圈，20μl用于pcr扩增切胶，剩余21μl文库可于-20℃长期保存。

6.illumina试剂盒扩增嵌合片段

1)将pcr仪设置如下参数，并预热pcr仪

2)参照如下体系依次加入试剂：

3)pcr扩增放大目的片段

7.片段筛选

1)1.5％agarose，100v约60min凝胶回收400-600bp片段，使用qiagen凝胶回收试剂盒进行操作，溶于20-30μleb，浓度≥3ng/μl；

图1为末端修复之前进行凝胶回收和不进行凝胶回收两种情况下的结果，后续进行pcr扩增的结果示意图。从图上可以看到，pcr在第6-8个循环即可产生足够的产物，且经凝胶回收片段筛选的文库，可显著减少非特异性扩增，文库大小集中在400-600bp(pcr扩增的文库会加上引物接头，接头长度约为120bp，所以pcr电泳图会比实际凝胶回收获得的片段大120bp左右)，而未经片段筛选的文库，非特异性扩增十分明显，片段范围增大至200-800bp。

2)回收产物使用agilent2100对文库大小分布进行检测，文库大小合适分布均匀，可以进行高通量测序。

图2为本实施例构建的钉螺hi-c的小片段dna文库的agilent2100大小检测图，结果表明主峰在483bp，且峰宽不超过400bp，是一个良好的文库大小分布峰图。

实施例2：

本实施例以钉螺hi-c连接产物dna为研究对象，对连接产物进行超声打断，凝胶回收300-500bp片段，最后进行文库构建，构建文库的中间步骤增加一步生物素捕获步骤，即可获得含有生物素标记的片段，再进行文库的pcr扩增，第二次凝胶回收400-600bp的片段，即可获得可上机测序的文库，在上机测序前进行agilent2100对文库大小分布进行检测，文库大小合适分布均匀，可以进行高通量测序。

测序完成后，对质控得到的cleandata，使用ice3软件对数据进行迭代比对，并进行噪音reads过滤。

表5钉螺dna小片段文库数据分析结果说明

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。