一种与豇豆荚色基因紧密连锁的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术及育种领域，特别涉及一种与豇豆荚色基因紧密连锁的snp分子标记及其应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，天然产物正逐渐取代化工合成产物在人们生活中所占的地位，在这种社会趋势中，天然来源的食品着色剂越来越受到人们的关注。在众多的天然色素中，花青素(anthocyanin)是自然界一类广泛存在于植物中的天然水溶性色素，是花色苷(anthocyains)水解得到的有颜色的苷元。因为花青素的颜色范围很宽，从红到蓝，包括桔黄色、紫色等，因其独特的性质成为了广为研究的对象；它在植物体中的分布也广，不仅存在于植物的花朵、果实中，在一些植物的茎、叶、根以及一些贮藏器官也含有大量花青素；更重要的是花青素具有超强的抗氧化能力，对人类许多慢性疾病如心脏病、癌症、帕金森症以及对衰老都有很好的预防和治疗作用。而豇豆豆荚紫红色素主体物质为花色苷类色素，随着科学研究的深入，社会的需求，人们越来越重视食品的营养保健作用，因此，选育高花青素豇豆是未来豇豆品质育种的重要目标之一。

用传统育种方式来选育紫红色豇豆品种虽然可行，但耗时耗力，不利于我国豇豆的育种事业的发展。随着高通量测序技术的逐渐成熟和成本的下降，特别是大量的snp(单碱基扩增多态性)标记的开发，应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。特别是豇豆的全基因组测序尚未完成，利用高通量测序技术开发与性状连锁的snp标记，可以进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，大大缩短了育种的周期、提高了育种的效率。因此，进行豇豆果荚颜色的基因定位，筛选与果荚颜色紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对高花青素含量的遗传改良具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供与豇豆荚色紧密连锁的snp标记位点，dcaps标记。开发及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种与豇豆荚色基因紧密连锁的snp分子标记，其为分子标记24729或分子标记17947，分子标记24729包含seqidno.1所示的核苷酸序列或其同源snp序列；分子标记17947包含seqidno.2所示的核苷酸序列或其同源snp序列。

进一步地，seqidno.1所示序列自5’端起第41位碱基是snp位点，其碱基为g或c。

进一步地，seqidno.2所示序列自5’端起第259位碱基是snp位点，其碱基为g或t。

可识别或扩增上述的snp分子标记的分子探针或引物对。

进一步地，引物对为dcaps引物对。

进一步地，用于检测分子标记24729的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1:5’-aatgatttaaacggcgttacagaaaggatc-3’(seqidno.3)；

r1:5’-tcttcattgctgggtatgcccttt-3’(seqidno.4)。

其对应的限制性核酸内切酶为bamhⅰ。

进一步地，用于检测分子标记17947的dcaps引物对的核苷酸序列如下所示：

f1:5’-ctgagcttatacattgagattccaattggc-3’(seqidno.5)；

r1:5’-tgctccaggcatggcagtgagatgtgatt-3’(seqidno.6)。

其对应的限制性核酸内切酶为mseⅰ。

上述的分子探针或引物对在豇豆荚色辅助育种中的应用。

一种用于豇豆荚色辅助育种的试剂盒，其包括上述的分子探针或引物对。

一种豇豆荚色辅助育种的方法，包括提取豇豆基因组dna，检测上述snp分子标记的类型，根据snp类型确定豇豆荚色。

本发明的有益效果是：本发明对豇豆荚色的质量性状位点进行了定位，并筛选得到了与豇豆荚色紧密连锁的分子标记24729和分子标记17947，两标记间的遗传距离为2.14cm，定位的位点对该质量性状存在显著关联关系(p<0.05)。通过这两个分子标记可以预测豇豆果荚颜色，为实现豇豆荚色性状的早期鉴定和筛选提供技术支持，同时大大缩短了传统育种的时间。

附图说明

图1分别为绿色豇豆母本(p1)，果荚颜色表型为绿色；紫红色豇豆为父本(p2)，果荚颜色表型为紫红色；

图2为豇豆荚色基因在高密度遗传连锁图谱的初步定位结果图：横坐标表示连锁群的位置，纵坐标表示lod值；红线表示所有的lod值拟合后的结果；虚线标记的阈值是代表p<0.05的关联阈值，表示关联性显著；

图3为豇豆荚色基因所在的6号连锁群的紧密连锁区间，左边为连锁群的遗传距离(cm)，右边为标记的编号，pp1为花青素基因所在位点；

图4为分子标记24729的pcr扩增后酶切结果：p1、p2分别为绿色豇豆母本和紫红豇豆父本的酶切带型，其中p2不能被酶切，片段长度为257bp，p1酶切完全，仅有一条232bp片段；f1部分酶切，存在257bp和232bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型；

图5为分子标记17947的pcr扩增后酶切结果：p1、p2分别为绿色豇豆母本和紫红豇豆父本的酶切带型，其中p2不能被酶切，片段长度为273bp，p2酶切完全，仅有一条243bp片段；f1部分酶切，存在273bp和243bp的片段，f2群体的随机单株中存在p1，p2和f1的三种类型。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括dna提取、pcr扩增、page凝胶电泳、酶切等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作即可，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(sambrookj,russelldw,janssenk,argentinej.黄培堂等译,2002,北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料：低花青素含量材料是本所育成的宝佳豇豆经多代自交获得的高代自交系，而高花青素含量材料是从湖南引进的紫红豇豆经多代自交获得的高代自交系。图1为p1和p2的植株照片，低花青素含量的母本(p1)，豆荚颜色为绿色；高花青素含量的父本(p2)，豆荚颜色为紫红色。宝佳豇豆和紫红豇豆杂交获得f1，f1自交获得f2，同时回交获得bc1，观察各世代的颜色，统计分离世代的颜色分离比，进行遗传分析，并对紫红色性状进行定位。

2、供试材料豆荚颜色遗传规律分析，田间性状统计结果显示，两亲本的正反交f1代植株均为紫红色；bc1(p2)紫红色，bc1(p1)紫红色与绿色出现1：1的分离；f2代紫红色与绿色出现3：1的分离。综上所述，紫红色对绿色性状为显性。表1为六世代群体果荚颜色性状的调查。

表1：六世代群体的荚色分离情况

二、豇豆遗传图谱构建和果荚颜色的初步定位

1、豇豆基因组dna的提取

使用ctab法提取豇豆2个亲本及150株f2群体基因组dna，提取的单株dna用于文库构建；

2、遗传图谱构建

本研究前期委托北京百迈客生物科技有限公司的slaf-seq技术进行高通量测序，一共150个样品，采用rsai和hincii酶进行酶切。对得到的酶切片段(slaf标签)进行3′端加a处理、连接dual-index测序接头、pcr扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用illuminahiseqtm进行pe125bp测序。为评估建库实验的准确性，选用日本晴水稻(oryzasatival.japonica)作为对照(control)进行相同的处理参与建库和测序。

为保证遗传图谱质量，将初始的多态性snp标签进行过滤，共获得11,625个snp标记，能成功分型的有32,262个，可以用于遗传图谱构建的标记有9,493个；经进一步筛选过滤，最终得到可用于作图的snp标签5,168个。将筛选出的5,168个snp标签，通过与参考基因组的定位将snp标签分为11个连锁群，通过两两标签之间计算mlod值，过滤掉与其他snp标签的mlod值均低于5的标签，共上图5,096个，定位为上图标记(marker)，上图率为98.61％。

每条染色体为一个连锁群(linkagegroup,lg)。以连锁群为单位，采用highmap软件分析，获得连锁群内marker的线性排列，并估算相邻marker间的遗传距离，最终得到总图距为1,504.64cm的遗传图谱。

3、豇豆荚色的遗传定位

利用构建的高密度遗传图谱，与表型数据进行关联分析，对荚色进行定位。本项目采用r/qtl进行定位分析，首先通过pt检验1000次设定阈值，先考虑0.99置信度对应的阈值，若没有定位区间则考虑0.95置信度对应的阈值；若没有定位区间则考虑0.90置信度的阈值。若仍没有结果则不考虑pt检验的结果，手动降低阈值到3.0；若3.0没有区间则降到2.5；若2.5没有区间则降到2。

关联分析结果表明，共获得1个性状关联区域，位于第6连锁群(lg6)末端(图2)，其在基因组上的具体位置如图3所示，

其中snp标记24729包括序列：

atgcttctttaatgatttaaacggcgttacagaaaggaacgcaaataaaacacgaattgcggaaatgaggaccattttaaacattcagtaaaaatgaggaccattttaaacattctgtcaaaatgagaactatccgcaacaaacactacgaaaatgaggacaaaaaggtatttaagctaactttttattgttgaaaaactttacgtgagtttcataaaatataaaagtttggtatctttttgtaaaagggcatacccagcaatgaagagcgtttt(seqidno:1)，其中下划线标记的c具有c→g的变化(即自5’端起第41位碱基是snp位点，其碱基为g或c)。

snp标记17947包括序列：

actgagcttatacattgagattccaattggctaataatattaagcttccctaatccgcacagtcaaggaacatgggcccaagcctaatttcccaagtctatcctatgctataacataaaattggcccctttcatccttattgtttacatagccttgtttctattcatattttcctccgtttgccagcagagtagttaattgcattctatatcactgcaaagcatcacagctacaggctgctcagtgcaaccccatactgtagtcacatctcactgccatgcctggagcaccatgaatcacggctgctatttgca(seqidno:2)，其中下划线标记的t具有t→g的变化(即自5’端起第259位碱基是snp位点，其碱基为g或t)。

三、dcaps分子标记开发、扩增、酶切验证

用于扩增分子标记24729的引物序列如下所示：

f1：5’-aatgatttaaacggcgttacagaaaggatc-3’(seqidno.3)；

r1：5’-tcttcattgctgggtatgcccttt-3’(seqidno.4)；

当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为g时，pcr产物不能被限制性核酸内切酶bamhⅰ识别并切割，片段长度为257bp，则果荚颜色为绿色。当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为c时，pcr产物可被限制性核酸内切酶bamhⅰ识别并切割，产生232bp的片段，可以判断与分子标记24729紧密连锁的豇豆荚色基因在果荚中的表型为紫红色。当该snp位点在两个等位基因中为g/c时，则存在257bp和232bp的片段，果荚颜色表型为紫红色。

用于扩增分子标记17947的引物序列如下所示：

f1:5’-tgagattccaattggctaataatattaagc-3’(seqidno.5)；

r1:5’-tgctccaggcatggcagtgagatgtgatt-3’(seqidno.6)。

当该snp位点在两个等位基因中只要有一个碱基为g时，pcr产物不能被限制性核酸内切酶mseⅰ识别并切割，片段长度为273bp，与分子标记17947紧密连锁的豇豆果荚颜色鉴定为绿色；当该snp位点在两个等位基因中的碱基均为t时，pcr产物可被限制性核酸内切酶mseⅰ识别并切割，产生243bp的片段，可以判断与分子标记17947紧密连锁的豇豆荚色基因在果实中的表型为紫红色。当snp位点的碱基为a/t时，则存在273bp和243bp的片段，豇豆果荚颜色表型为紫红色。

pcr扩增体系使用20μl的扩增体系，包含1utaq酶，1μl模板dna，0.5μl的dntp，1.5μl引物，2.5μl的10×pcrbuffer，加ddh2o至20μl。pcr扩增程序为：94℃4min，循环过程为94℃40s、退火30s、72℃30s、30个循环，最后72℃延伸10min。24729引物的退火温度为56℃，17947引物的退火温度为58℃。

在两亲本间进行pcr扩增，分别经过限制性内切酶bamhⅰ和mseⅰ进行酶切后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图4、5)，亲本间表现特异，鉴定f2群体单株50个，两个标记的结果一致，且果荚颜色与双酶切结果一致，上述两个snp标记可以将豇豆果荚颜色区分开。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院蔬菜研究所

<120>一种与豇豆荚色基因紧密连锁的snp分子标记及其应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>275

<212>dna

<213>豇豆

<400>1

atgcttctttaatgatttaaacggcgttacagaaaggaacgcaaataaaacacgaattgc60

ggaaatgaggaccattttaaacattcagtaaaaatgaggaccattttaaacattctgtca120

aaatgagaactatccgcaacaaacactacgaaaatgaggacaaaaaggtatttaagctaa180

ctttttattgttgaaaaactttacgtgagtttcataaaatataaaagtttggtatctttt240

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<210>2

<211>314

<212>dna

<213>豇豆

<400>2

actgagcttatacattgagattccaattggctaataatattaagcttccctaatccgcac60

agtcaaggaacatgggcccaagcctaatttcccaagtctatcctatgctataacataaaa120

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<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

aatgatttaaacggcgttacagaaaggatc30

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

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<212>dna

<213>人工合成

<400>5

tgagattccaattggctaataatattaagc30

<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

tgctccaggcatggcagtgagatgtgatt29