一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的间接ELISA试剂盒与流程

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于诊断猪尔塔冠状病毒感染的抗原，制备该抗原的方法，以及用该抗原制备的检测猪尔塔冠状病毒抗体的间接elisa试剂盒。

背景技术：

猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，pdcov)是一种新发现的冠状病毒，可引起猪，特别是新生仔猪腹泻，其引发的临床表现与已知的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻非常相似，容易混淆，感染后可导致较高的发病率和死亡率，是近年来在多个国家和地区造成新生仔猪死亡的重要原因之一。pdcov最早于2012年由香港学者首次发现(woopc,etal.discoveryofsevennovelmammalianandaviancoronavirusesinthegenusdeltacoronavirussupportsbatcoronavirusesasthegenesourceofalphacoronavirusandbetacoronavirusandaviancoronavirusesasthegenesourceofgammacoronavirusanddeltacoronavirus.journalofvirology,2012,86(7):3995-4008.)，2014年在美国首次发生大规模流行(lig,etal.full-lengthgenomesequenceofporcinedeltacoronavirusstrainusa/ia/2014/8734.genomeannouncements,2014,2(2)：e00278-14.)，随后在韩国，中国等地相继被检测到(lees,etal.completegenomecharacterizationofkoreanporcinedeltacoronavirusstrainkor/knu14-04/2014.genomeannouncements,2014,2(6)：e01191-14.；chenf,etal.2015.full-lengthgenomecharacterizationofchineseporcinedeltacoronavirusstrainch/sxd1/2015.genomeannouncements,3(5):e01284-15；)，呈现出全球流行的潜在趋势。目前对于该病毒的感染没有有效的抗病毒治疗药物和疫苗，对其感染监控也缺乏有效的手段。

抗体的检测是兽医临床监测传染病感染的最常用手段之一，尤其是对于未经疫苗免疫的群体尤其适用，一旦检测出抗体阳性，即可证明该群体发生了感染。目前常用的抗体检测技术包括间接免疫荧光技术(ifa)、酶联免疫吸附试验(elisa)等，其中以elisa技术最适合于对动物群体进行高通量快速检测。抗体检测试剂质量取决于抗原的性能，由于猪德尔塔冠状病毒在体外进行培养相对比较困难，从天然病毒提取制备抗原的程序繁琐、成本较高、产量有限，而且还存在散毒的风险。通过基因工程技术进行抗原表达是制备检测抗原的最佳途径。在猪德尔塔冠状病毒的抗原中，核衣壳蛋白(n)是一种最佳候选抗原，n蛋白是猪德尔塔冠状病毒感染宿主细胞后在病毒复制过程中产生的早期蛋白，也是成熟病毒粒子中最主要的结构蛋白之一，与病毒粒子表面囊膜蛋白相比n蛋白保守性更好，病毒感染后在感染动物体内最早可检出的抗体即是针对n蛋白的抗体，因此检测n蛋白抗体可用于病毒感染的早期诊断。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法，该抗原代表猪德尔塔冠状病毒n蛋白中抗原表位集中的区域，具有高度的特异性和免疫反应性。

本发明的目的之二是提供一种利用上述抗原制备的检测猪德尔塔冠状病毒抗体的间接elisa试剂盒。

本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了含有按照大肠杆菌密码子使用偏嗜性进行优化设计的pdcovn基因优势抗原编码区的原核表达质粒，将该质粒转化入bl21(de3)感受态细胞进行高效可溶性表达，通过细胞破碎释放表达的重组蛋白，进而采用合适的亲和层析方法进行纯化获得高纯度的蛋白抗原，进一步将纯化的蛋白抗原作为包被抗原建立间接elisa抗体检测试剂盒，用于检测pdcov特异性抗体，对于未经疫苗免疫的猪群，监测到特异性抗体阳性反应即可确定该猪群已经发生野毒感染。

实现本发明目的的技术方案是：

一种猪德尔塔冠状病毒抗原的制备方法，是选取猪德尔塔冠状病毒n基因796～1026nt核苷酸区域，按照大肠杆菌密码子使用偏嗜性对该核苷酸区域进行优化设计，优化的基因片段如seqno.2，优化的基因片段克隆入pet-32a(+)载体并在大肠杆菌bl21(de3)中进行高效可溶性表达，进而通过ni-nta亲和层析方法进行纯化而获得。

本发明所述的检测猪德尔塔冠状病毒抗体的间接elisa试剂盒，包括包被有重组n蛋白表达产物的酶标板、阳性和阴性对照、hrp标记的兔抗猪二抗、样品稀释液、显色液以及洗涤液。

进一步地，所述包被有猪德尔塔冠状病毒抗原的elisa酶标板，是通过将猪德尔塔冠状病毒抗原(即纯化的n蛋白原核表达产物)包被于96孔酶标板而制备。

本发明所述的猪德尔塔冠状病毒抗原，可以通过以下步骤得到：

(1)pdcovn蛋白优势抗原编码区的优化设计与合成，选取本实验室测定的pdcovchn/tianjin/2016株n基因序列(genbank登录号：ky065120)，经生物信息学分析，挑选其中抗原表位最集中的一段优势抗原编码区(seqno.1)，根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性规律，对该基因片段进行密码子优化设计，为方便克隆，基因片段两端分别加上bamhi和xhoi限制性内切酶识别位点，优化的基因片段(seqno.2)委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。

(2)重组表达质粒的构建：利用限制性内切酶bamhi和xhoi，将人工合成的n基因片段定向克隆入pet-32a(+)载体相应位点之间，获得重组表达载体pet-32a-pdcov-n(见图1)，将重组表达载体进一步转化到bl21(de3)感受态细胞，获得的重组菌命名为bl21(de3)/pet-32a-pdcov-n。

(3)n蛋白的表达：将对数生长期的重组菌bl21(de3)/pet-32a-pdcov-n以1:100的比例接种于添加氨苄青霉素的液体lb培养基中，250r/min剧烈震荡培养至菌液od600nm在0.4～0.6之间，在不同浓度的iptg和不同的诱导时间条件下进行诱导表达条件的优化。诱导完成后离心收集细菌，pbs(ph7.2)洗涤2次后用pbs(ph7.2)重悬菌体沉淀，然后用超声裂解仪进行破碎，离心后分别收集上清和沉淀，通过sds-page鉴定重组蛋白的最佳可溶性表达条件。

(4)包被用猪德尔塔冠状病毒抗原(n蛋白)的纯化：采用上述确定的最佳诱导表达条件进行重组菌的诱导表达，经超声裂解仪进行破碎后将包含可溶性融合表达蛋白产物(his-n)的重组菌裂解上清经ni-nta亲和层析柱纯化后得到包被用n蛋白。

本发明所述的检测pdcov抗体的间接elisa试剂盒，包括包被有重组n蛋白的酶标板，阳性和阴性对照(阳性对照为抗pdcov的猪多抗血清，阴性对照为阴性猪血清)，hrp标记的兔抗猪二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％tween-20的pbst)，显色液(tmb显色液)及洗涤液(含0.05％tween-20的pbst)。

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明包括提供了一种猪德尔塔冠状病毒抗原的制备方法，通过对病毒n蛋白优势抗原编码区进行密码子设计，合成了符合大肠杆菌密码子使用偏嗜性的优化n基因序列，这一序列确保了重组蛋白在大肠杆菌表达系统中表达效率更高，且更加有利于形成可溶性表达产物。因为制备的抗原仅含有n蛋白中最优势的抗原表位区，因此免疫原性和反应性强。

(2)本发明还制备出了一种检测猪德尔塔冠状病毒病毒抗体的间接elisa试剂盒。该试剂盒能特异性地检测出pdcov抗体，而与抗猪流行性腹泻病毒(pedv)阳性血清、抗传染性胃肠炎病毒(tgev)阳性血清、抗猪轮状病毒(prov)阳性血清以及猪阴性血清不反应，因此该试剂盒具有良好的特异性。由于目前国内外尚未研制出预防pdcov感染的疫苗，因此猪群只要检出n蛋白抗体阳性，就可以确定为pdcov感染。相对于通过核酸检测方法进行病原学检测，本发明更加适用于pdcov感染流行病学调查中对猪群进行群体性高通量筛查。

附图说明

图1是本发明选择的猪德尔塔冠状病毒n蛋白优势抗原编码区优化前后的核苷酸序列比对结果图，n代表优化前的核苷酸序列，n-opti代表优化后的核苷酸序列。

图2是本发明构建的重组表达载体pet-32a-pdcov-n结构示意图。

图3是重组表达载体pet-32a-pdcov-n经bamhi和xhoi双酶切鉴定电泳图(m：dnamarker；泳道1：重组表达载体pet-32a-pdcov-n酶切后可产生5.4kb大小的载体条带和234bp大小的目的条带；泳道2：pet-32a(+)空载体酶切后仅观察到5.4kb大小的载体条带)。

图4是重组蛋白表达sds-page鉴定图(m：蛋白marker；泳道1：重组菌裂解产物上清；泳道2：重组菌裂解产物沉淀；泳道3：阴性对照菌裂解产物上清；泳道4：阴性对照菌裂解产物沉淀)。

图5是重组蛋白表达western-blot鉴定图(m：蛋白marker；泳道1：重组菌裂解产物上清；泳道2：重组菌裂解产物沉淀；泳道3：阴性对照菌裂解产物上清；泳道4：阴性对照菌裂解产物沉淀)。

图6是重组蛋白纯化效果的sds-page鉴定图(m：蛋白marker；泳道1：重组菌裂解产物上清；泳道2：蛋白过柱滤出液；泳道3：洗涤液首管；泳道4：洗涤液末管；泳道5：洗脱蛋白)。

图7是本发明试剂盒特异性试验结果。

本发明中所涉及的重组菌bl21(de3)/pet-32a-pdcov-n，于2018年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号cctccno：m2018858；分类命名为：大肠杆菌bl21(de3)/pet-32a-pdcov-n，escherichiacolibl21(de3)/pet-32a-pdcov-n。

具体实施方式

下面将通过附图和具体实施方例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例1：猪德尔塔冠状病毒抗原的制备

(1)pdcovn基因的获取：通过对本实验室测定的pdcovchn/tianjin/2016株n基因序列(genbank登录号：ky065120)进行生物信息学分析，选取其中抗原性较好的796～1026nt核苷酸区域(seqno.1)，根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性规律，对该基因片段进行密码子优化设计(优化前后的基因核苷酸序列差异见图1)，为方便克隆，基因片段两端分别加上bamhi和xhoi限制性内切酶识别位点，优化的基因片段(seqno.2)委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。

(2)重组表达质粒pet-32a-pdcov-n的构建：利用限制性内切酶bamhi和xhoi，将人工合成的n基因片段定向克隆入pet-32a(+)载体相应位点之间，获得重组表达载体pet-32a-pdcov-n(见图2)，重组载体经bamhi和xhoi双酶切之后经琼脂糖凝胶电泳鉴定可观察到5.4kb大小的载体条带和234bp大小的目的条带，而pet-32a(+)空载体双酶切后仅观察到5.4kb大小的载体条带(见图3)。将重组表达载体进一步转化到bl21(de3)感受态细胞，获得的重组菌命名为bl21(de3)/pet-32a-pdcov-n。

(3)n蛋白的诱导表达与鉴定：将培养至对数生长期的重组菌bl21(de3)/pet-32a-pdcov-n以1:100的比例接种于添加100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，250r/min振荡培养至菌液od600nm在0.4～0.6之间，加入iptg至终浓度为0.1～1.0mmol/l，进行诱导表达，3～5h后收集细菌，用pbs(ph7.2)洗涤2次后用pbs(ph7.2)重悬菌体沉淀，然后60hz，间隔3s进行超声破碎，破碎完成后离心分离上清和沉淀。分别通过sds-page和western-blot对表达产物进行分析。图4为0.5mmol/liptg诱导5h的细菌裂解产物上清和沉淀的sds-page电泳图，由图中可见表达产物大部分在上清中，说明以可溶性表达为主。图5为重组蛋白表达western-blot鉴定，有图中可以看出，表达产物与阳性血清反应可产生特异性条带。

实施例2：检测pdcovn蛋白特异性抗体的间接elisa试剂盒制备

本发明所述检测pdcov抗体的间接elisa试剂盒，可以通过下述步骤得到：

制备检测pdcov抗体的抗原：检测抗原为将实施例1中经诱导表达的重组菌裂解上清经ni-nta亲和层析柱纯化获得，纯化效果通过sds-page进行检测(图6)。

检测猪德尔塔冠状病毒抗体的间接elisa试剂盒组装及特性：该试剂盒包括包被有重组n蛋白的酶标板，阳性和阴性对照(阳性对照为抗pdcov的猪多抗血清，阴性对照为阴性猪血清)，hrp标记的羊抗猪二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％tween-20的pbst)，显色液(tmb显色液)及洗涤液(含0.05％tween-20的pbst)。

该试剂盒检测pdcov抗体的步骤及阳性判断标准如下：使用前所有试剂应回复至室温(18～25℃)，试剂应轻轻旋转或振荡混合，每个样品试用单独的吸头；首先吸取100μl阳性对照加入孔中，做2次重复，吸取100μl阴性对照加入孔中，做2次重复，阴阳性对照均不需要稀释；剩下的孔用于检测待检血清样品(1:100稀释)，稀释好的血清样品加入孔中后，用封口膜封住孔，将酶标板置于37℃反应1h；pbst洗涤3遍后拍干，加入1:5000稀释的hrp标记的羊抗猪igg抗体，用封口膜封住孔，将酶标板置于37℃反应1h；pbst洗涤3遍后拍干，加入tmb显色液显色15min；最后直接加入终止液(2mh2so4)终止显色，酶标仪读取od450nm值。

符合下列条件，结果方能有效：阳性对照的平均值必须大于或等于1.0，阴性对照的平均值必须小于或等于0.2；如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，应按照标准操作重做一次试验。试验成立的情况下，od450nm大于或等于0.3的孔判定为阳性，od450nm小于0.3的孔判定为阴性。经特异性试验检测，该试剂盒仅与抗pdcov抗体的阳性血清反应，而与抗pedv血清、抗tgev血清、抗prov血清以及猪阴性血清均不反应(见图7)。

实施例3临床样品检测效果

对采集自天津某已确诊pdcov感染发病猪场的20份阳性血清和采集自某阴性猪场的20份阴性血清进行了检测，如表1所示，20份阳性血清检测结果均为阳性，20份阴性血清检测结果均为阴性。

表1临床样品elisa检测结果

注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。

以上检测结果证明，本发明的基于n蛋白的检测pdcov抗体的间接elisa试剂盒具有良好的特异性，可以用于临床猪群感染pdcov的监测。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的间接elisa试剂盒

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>234

<212>dna

<213>猪德尔塔冠状病毒（porcinedeltacoronavirus）

<400>1

acagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgtt60

aaccagacctatgagccacctaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagac120

cagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacctaaaaaggtaactctgccagcagacaaa180

caggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatcagcagcgtag234

<210>2

<211>234

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acggttaaagaaggcagtccggattatgaacggctgaaagacgccttgaacacggtcgtt60

aatcagacatatgaaccacccaccaaaccgaccaaagataaaaagccggataaacaggac120

caaagtgcgaagccaaagcagcaaaaaaaacctaaaaaagtcaccttgccagccgataaa180

caagattgggagtgggatgacgcattcgaaattaaacaagaaagcgctgcgtaa234