一种丛生福禄考ISSR-PCR分子标记辅助育种方法与流程

本发明涉及一种丛生福禄考issr-pcr分子标记辅助育种的方法。

技术背景

丛生福禄考(phloxsubulatal.)为花荵科福禄考属宿根花卉，匍匐性草甸状，茎丛生密集成垫状并沿地面生长，在我国东北地区可正常越冬。作为一种应用前景广阔的地被植物，花色丰富艳丽，每当开花季节，繁盛的花朵将茎叶全部遮住，形成花海、繁花似锦，不但可以栽植于平坦地面，还可以在普通草坪、花卉不易生长养护的零散隙地、陡峭山坡等地种植。丛生福禄考，具有观赏价值高、适应性强、耐粗放管理等优良特性，是一种不可多得的园林应用材料。然而，丛生福禄考品种多样，亲缘关系复杂，给育种带来了很大的困难。

分子标记辅助育种作为一种现代育种手段，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。简单重复序列多态性(issr)可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下，进行遗传多样性分析，为物种演化和分类研究提供dna水平上的证据；可以同时检测基因组多个ssr位点；可以采取类似rapd的方法寻找与所定位基因组相连锁的dna标记，快速完成基因定位；可以在生长周期的任何阶段进行检测，且dna用量少；通常为显性标记。issr分子标记技术已被广泛应用于许多植物的遗传多样性分析中,但对于丛生福禄考分子标记的研究现仍处于起步阶段。

技术实现要素：

一种丛生福禄考issr-pcr分子标记辅助育种的方法，包括以下步骤：

1)提取丛生福禄考基因组dna；

2)issr-pcr扩增。

步骤2)issr-pcr扩增反应体系：在25μl反应体系中，包括10×buffer(mg²⁺free)2.5μl，dntps0.15mmol/l，引物800pmol/l，dna模板40ng，taq酶1.5u，mgcl2为3mmol/l。

所述的引物选自seqidno.1-11中的任一条，如下表1所示：

表1引物信息表

步骤2)issr-pcr扩增的条件为：95℃预变性8min，30个循环，每个循环包括，94℃变性30s，48-55℃退火1min，72℃延伸2min，结束循环后72℃延伸10min。

本发明建立的丛生福禄考issr-pcr反应体系，条带稳定性高，清晰度高，弥补了国内外对丛生福禄考遗传多样性研究的不足，发明的成果可用于丛生福禄考遗传关系、分子标记辅助育种、新品种选育等方面，具有很大的科学价值与应用价值。

附图说明

图1是issr-pcr正交试验设计反应体系的扩增结果：

m表示：dl2000marker；引物为fi-48；1-16为表2的处理组合1-16。

图2是筛选出的适合丛生福禄考issr扩增的引物扩增结果：

m表示：dl2000marker；1.fi-8；2.fi-18；3.fi-20；4.fi-35；5.fi-40；6.fi-43；7.fi-48；8.fi-49；9.fi-50；10.fi-55；11.fi-59。

图3是引物fi-48最佳退火温度的确定：

m表示：dl2000marker；1.48℃；2.50℃；3.52℃；4.56℃；5.60℃。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

1提取丛生福禄考基因组dna；

2扩增体系的优化：

1、正交优化设计筛选issr最优反应体系(5因素4水平)，采用l16(4⁵)正交试验设计，对mg²⁺浓度、dntps浓度、引物浓度、taqdna聚合酶以及模板dna进行5因素4水平筛选(方案见表2)。以fi-48为引物，利用表2中的16个体系，对丛生福禄考基因组dna进行issr扩增。反应体系为25μl反应体系，除表中各因素，还包括10×buffer(mg²⁺free)2.5μl。扩增程序为95℃预变性8min，30个循环，每个循环包括，94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，结束循环后72℃延伸10min。

表2是issr-pcr正交试验设计表[l16(4⁵)]

按表2设计的16个处理进行pcr反应后，将得到的产物进行电泳检测，按照正交设计分析方法，图1为16个处理的的pcr产物电泳结果，依扩增出的谱带特异性与敏感性即谱带多少、亮度的强弱和杂带的有无进行评分。条带越多、亮度越高、无弥散现象评分越高，反之评分越少。最好的处理定为16分，最差的处理定为1。

2、依照标准评分。

依照这样的标准图1中各种处理的得分结果依次为：3、6、12、2、6、5、11、1、10、11、6、15、8、7、12、4；第2次重复的计分依次为：4、6、11、1、6、6、11、1、10、10、6、14、8、7、10、4；第3次重复的计分依次为：3、5、12、1、7、5、12、1、9、11、6、14、7、6、12、4。3次判读结果有较强的一致性。

3、评分结果方差分析。

将正交处理和结果评分用spss统计软件进行方差分析，结果见表3。由f值可知mg²⁺浓度对反应结果影响最大，模板dna浓度影响最小。其中mg²⁺浓度、taq酶量和dntps浓度对反应结果影响大，均达到极显著。引物的影响也达到了显著水平。各因素对pcr反应影响大小依次为：mg²⁺、taq酶、dntps、引物、模板dna。对达到显著水平的各因素进行因素内比较。

表3方差分析表

4、因素内多重比较后，最终确定dntps0.15mmol/l，引物800pmol/l，dna模板40ng，taq酶1.5u，mgcl2为3mmol/l，10×buffer(mg²⁺free)2.5μl为25μl体系最佳处理组合。

实施例3引物筛选及最佳退火温度确定

采用优化后的体系,对加拿大哥伦比亚大学提供的100个引物进行筛选,筛选出的引物和最佳退火温度见表1。试验设定了5个退火温度：48℃，50℃，52℃，56℃，60℃，以引物fi-48为例，当退火温度低于50℃，高于56℃时扩增片段不完整，当退火温度在50℃到56℃之间时，条带比较清晰完整。综合考虑引物fi-48的最佳退火温度为52℃(图3)。

5、结论

利用正交试验设计，从mg²⁺浓度、dntps浓度、引物浓度、taqdna聚合酶以及模板dna5因素4水平，对丛生福禄考issr-pcr反应体系进行优化分析。结果表明：25μl体系中，10×buffer(mg²⁺free)2.5μl，dntps0.15mmol/l，引物800pmol/l，dna模板40ng，taq酶1.5u，mgcl2为3mmol/l。95℃预变性8min，30个循环，每个循环包括，94℃变性30s，48-55℃退火1min，72℃延伸2min，结束循环后72℃延伸10min，扩增效果最好。为丛生福禄考遗传多样性研究奠定基础。

本发明涉及一种丛生福禄考issr-pcr分子标记方法，包括以下步骤：1)提取丛生福禄考的基因组dna，2)进行issr-pcr；步骤2)issr-pcr扩增反应体系为：在25μl反应体系中，包括10×buffer(mg2+free)2.5μl，dntps0.15mmol/l，引物800pmol/l，dna模板40ng，taq酶1.5u，mgcl23mmol/l。以引物fi-48为例，pcr扩增条件：95℃预变性8min，30个循环，每个循环包括，94℃变性30s，48-55℃退火1min，72℃延伸2min，结束循环后72℃延伸10min。本发明提供的丛生福禄考issr-pcr条带清晰，多态性高。本发明的成果可以用于丛生福禄考的遗传多样性及遗传分化方面的研究。