检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物探针组合及其应用。涉及的vanc、vane、vang、vanl和vann操纵子的耐药机制为通过将肽聚糖前体c端d-ala残基替换为d-ser使宿主产生耐药，仅对万古霉素表现出中低程度的耐药，而对替考拉宁无效。

背景技术：

糖肽类抗生素(glycopeptides，gaps)是一类具有七肽结构的抗生素，由氨基酸与糖残基、氯原子、甲基和/或脂链组成。用于治疗人类感染的重要的糖肽类抗生素包括第一代万古霉素(vancomycin)和替考拉宁(teicoplanin)，尽管二者分别早在1958年和1988年就被批准用于临床，但目前仍在临床实践中广泛使用。第二代糖肽类抗生素telavancin、dalbavancin和oritavancin分别于2013年和2014年被批准用于临床。与第一代糖肽类抗生素相比，第二代抗生素表现出更强的抗菌能力和更优越的药代动力学特性。

糖肽类药物通过结合到细菌细胞壁肽聚糖前体的d-ala-d-ala末端来抑制肽聚糖(pg)的合成，使细菌不能正常合成细胞壁，从而达到抗菌效果。gaps是治疗由革兰氏阳性病原体(如金黄色葡萄球菌、肠球菌属和艰难梭菌)引起的严重感染的最后手段。1988年欧洲首次报道了耐万古霉素肠球菌临床分离株。从那时起，耐万古霉素的肠球菌以意想不到的速度传播，现在在大多数国家的医院都有发现。

研究发现，细菌对糖肽类药物的抗性是由于细菌中存在编码一系列蛋白的操纵子，其产物用来合成与糖肽类药物低亲和力的肽聚糖前体，包括肽聚糖前体c端d-ala残基被d-lac或d-ser取代，通过修饰糖肽类药物结合靶点使其失效；或者是由于细菌编码蛋白，消除通常由宿主产生的高亲和力前体，去除糖肽类药物结合靶点，从而产生耐药。

目前已经在革兰氏阳性菌中发现13类糖肽类耐药操纵子，其中9种存在于肠球菌，4种存在于其他革兰氏阳性菌中。肠球菌中发现的vana、vanb、vand和vanm操纵子组成虽有差异，但其核心的耐药机制都是通过将肽聚糖前体c端d-ala残基替换为d-lac，降低糖肽类药物与肽聚糖前体的亲和力，最终表现为对万古霉素的高度耐药，以及对替考拉宁(vanb除外)的高度耐药。而vanc、vane、vang、vanl和vann操纵子的耐药机制与上述几种操纵子略有不同，通过将肽聚糖前体c端d-ala残基替换为d-ser使宿主产生耐药，但仅对万古霉素表现出中低程度的耐药，而对替考拉宁无效。

目前对糖肽类药物耐药性的检测方法有两类，即表型检测和基因型检测。表型检测通过在糖肽类药物存在的情况下培养病原菌，通过抑菌圈大小，或测定半致死药物浓度(mic50)进行。表型检测步骤复杂，耗时长，整个过程至少需48-72小时，病原菌分离培养过程中，由于没有抗生素选择压力，可能使携带van操纵子的质粒等发生丢失，导致后续的药物敏感性检测得出假阴性的结果。有鉴于此，国际上越来越多的细菌耐药性研究者建议采用基因型检测方法。通过聚合酶链式反应(pcr)、测序等方法，直接检测细菌是否携带与糖肽类药物耐药性相关的基因，其优点是可提供基因水平的耐药信息，可在样品收集后24小时内得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。但pcr方法也存在仅根据扩增产物片段大小判断结果的不确定性，以及测序数据分析较复杂等缺点，影响检测结果可靠性和广泛推广。

现有的基因型检测方法多针对vana、vanb型糖肽类耐药基因，而针对本发明所涉及的vanc、vane、vang、vanl和vann型糖肽类耐药基因的检测方法极少报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann的引物探针组合及其应用。

为解决上述技术问题，本发明首先提供检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物组合和探针组合：包括对五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann进行特异性扩增的引物组合，引物如序列1-10所示；还包括检测五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann的特异性探针组合，探针如序列11-15所示。

引物组1包括vanc基因特异性引物，具体为vanc基因正向引物(序列1)和vanc基因反向引物(序列2)；引物组2包括vane基因特异性引物，具体为vane基因正向引物(序列3)和vane基因反向引物(序列4)；引物组3包括vang基因特异性引物，具体为vang基因正向引物(序列5)和vang基因反向引物(序列6)；引物组4包括vanl基因特异性引物，具体为vanl基因正向引物(序列7)和vanl基因反向引物(序列8)，引物组5包括vann基因特异性引物，具体为vann基因正向引物(序列9)和vann基因反向引物(序列10)。

本发明设计的引物组合具有相同的参数范围，以保证各组引物在相同的反应条件下都能正常工作。具体为：引物长度范围在15-25个寡核苷酸之间，最优为20个寡核苷酸；引物tm值范围在45-65℃之间，最优为56℃；正向、反向引物之间tm值最多相差3℃，最优为0℃；pcr产物长度范围在100-1000bp之间，最优为200-400bps。

所述的探针组合由探针1-5组成。探针1包括vanc基因特异性探针(序列11)；探针2包括vane基因特异性探针(序列12)；探针3包括vang基因特异性探针(序列13)；探针4包括vanl基因特异性探针(序列14)；探针5包括vann基因特异性探针(序列15)。

本发明设计的探针具有相同的参数范围，以保证各个探针在相同的反应条件下都能正常工作。具体为：探针长度范围在15-30个寡核苷酸之间，最优为20个寡核苷酸；探针的杂交温度范围在48-70℃之间，最优为56℃；探针的gc含量范围在20％-80％之间，最优为50％。

具体如下表1所述：

表1

所述引物组合中，所述引物组1、2、3、4、5的摩尔比可为1:1.5:1.5:1:1。

所述探针组合中，所述探针1、2、3、4、5在杂交反应中应等量应用。

本发明还同时提供了特异性检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的试剂盒，包括如上所述的引物组合(如序列1-10所示)和特异性探针组合(如序列11-15所示)。

作为本发明的试剂盒的改进：还包括pcr扩增反应液、杂交反应液。

注：pcr扩增反应液和/或杂交反应液可以是商品化的pcr扩增反应液和/或杂交液，也可以是符合pcr扩增和杂交反应原理的自制反应液。

作为本发明的引物探针组合、试剂盒的应用，为以下任一用途：

1)、鉴定耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann中的至少一种(即，为任意一种，或任意2种、3种、4种的组合)；

2)、检测待测菌是否含有糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann中的至少一种；

3)、检测待测样本中是否含有糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann中的至少一种。

作为本发明的引物探针组合、试剂盒的应用的改进：

1)、提取待测样本/待测菌的总dna；

2)、以步骤1)提取的总dna为模板，采用特异性引物组合进行pcr扩增；

3)、将步骤2)获得的pcr扩增产物与所述的特异性探针分别进行杂交，然后如下进行判断：

如果探针的杂交结果为阳性，则该阳性探针所对应的耐药基因存在于该待测样本/待测菌中。

即：如果所述的特异性探针组合中，有一条或多条探针的杂交结果为阳性，则该阳性探针所对应的耐药基因存在于该待测菌(或待测样本)中；如果所述的特异性探针组合的杂交结果均为阴性，则该待测菌(或待测样本)中不存在所述的五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann中的任何一种。

所述的待测样本可以是含有细菌的环境样本(土壤、水体等)，也可以是来源于人体或动物的样本(粪便、脓液等)。

本发明提供的特异性引物组合和探针组合用于检测五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann，具有高特异性、高灵敏度、快速、同步检测和涵盖度，不仅可用于对肠球菌感染样本(人体感染样本)中五种糖肽类药物耐药基因的检测，提示对万古霉素等的耐药程度，为临床抗感染治疗用药提供参考依据，同时对糖肽类药物耐药的发展进行监测；还可用于动物及环境样本中五种糖肽类药物耐药基因的分布及转移情况的监测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为五种糖肽类药物耐药基因的特异性探针点阵排布图；

图2为五种糖肽类药物耐药基因的特异性检测结果图(杂交后)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是限制本发明。

下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。

实施例1、五种糖肽类药物耐药基因的引物组合和探针组合的涵盖度和特异性

本实施例通过如下步骤对本发明所述的检测五种糖肽类药物耐药基因的引物组合和探针组合的涵盖度和特异性进行说明。

步骤1：从抗生素耐药权威数据库—抗生素综合耐药数据库(thecomprehensiveantibioticresistancedatabase，card)下载本发明涉及的五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann的参考序列：af162694(vanc)、fj872411(vane)、dq212986(vang)、eu250284(vanl)和jf802084(vann)。

步骤2：将上述五种耐药基因的参考序列分别提交ncbi进行在线blast比对，比对数据库为非冗余核酸数据库(20190315版本)。其中，vanc基因参考序列af162694共获得35条比对序列，vane基因参考序列fj872411共获得4条比对序列，vang基因参考序列dq212986共获得23条比对序列，vanl基因参考序列eu250284共获得3条比对序列，vann基因参考序列jf802084共获得5条比对序列。

步骤3：将上述五种耐药基因的参考序列检索到的比对序列合并，然后进行一一核实，仅保留序列注释分别为vanc、vane、vang、vanl和vann的比对序列，以及基因注释未明确但与参考序列一致性在95％(含)以上的比对序列，组成数据集a；筛选后剩余的比对序列组成数据集b。

数据集a应被认为是截止比对数据库版本日之前，所有已发现并完成测序的vanc、vane、vang、vanl和vann基因的序列集合；数据集b应被认为是截止比对数据库版本日之前，所有已发现并完成测序的与vanc、vane、vang、vanl和vann基因相似度最高的序列集合。

经筛选，数据集a包含35条序列，包括：vanc基因比对序列15条，vane基因比对序列2条，vang基因比对序列13条，vanl基因比对序列2条，vann基因比对序列3条；数据集b包含35条序列，包括：vanc基因比对序列20条，vane基因比对序列2条，vang基因比对序列10条，vanl基因比对序列1条，vann基因比对序列2条。

步骤4：将本发明所采用的检测五种糖肽类药物耐药基因的引物组合和探针组合分别于上述数据集a和b进行比对，结果显示：

本发明所采用的引物组1所含的vanc基因扩增引物与数据集a中15条vanc基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组1所含的vanc基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vanc基因及其突变基因，具有高度的vanc基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组1所含的vanc基因扩增引物对vane、vang、vanl和vann基因，以及与vanc基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vanc基因特异性。

本发明所采用的探针1所含的vanc基因特异性探针序列与数据集a中15条vanc基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针1所含的vanc基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vanc基因及其突变基因，具有高度的vanc基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针1所含的vanc基因特异性探针对vane、vang、vanl和vann基因，以及与vanc基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vanc基因特异性。

本发明所采用的引物组2所含的vane基因扩增引物与数据集a中2条vane基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组2所含的vane基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vane基因及其突变基因，具有高度的vane基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组2所含的vane基因扩增引物对vanc、vang、vanl和vann基因，以及与vane基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vane基因特异性。

本发明所采用的探针2所含的vane基因特异性探针序列与数据集a中2条vane基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针2所含的vane基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vane基因及其突变基因，具有高度的vane基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针2所含的vane基因特异性探针对vanc、vang、vanl和vann基因，以及与vane基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vane基因特异性。

本发明所采用的引物组3所含的vang基因扩增引物与数据集a中13条vang基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组3所含的vang基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vang基因及其突变基因，具有高度的vang基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组3所含的vang基因扩增引物对vanc、vane、vanl和vann基因，以及与vang基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vang基因特异性。

本发明所采用的探针3所含的vang基因特异性探针序列与数据集a中13条vang基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针3所含的vang基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vang基因及其突变基因，具有高度的vang基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针3所含的vang基因特异性探针对vanc、vane、vanl和vann基因，以及与vang基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vang基因特异性。

本发明所采用的引物组4所含的vanl基因扩增引物与数据集a中2条vanl基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组4所含的vanl基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vanl基因及其突变基因，具有高度的vanl基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组4所含的vanl基因扩增引物对vanc、vane、vang和vann基因，以及与vanl基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vanl基因特异性。

本发明所采用的探针4所含的vanl基因特异性探针序列与数据集a中2条vanl基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针4所含的vanl基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vanl基因及其突变基因，具有高度的vanl基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针4所含的vanl基因特异性探针对vanc、vane、vang和vann基因，以及与vanl基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vanl基因特异性。

本发明所采用的引物组5所含的vann基因扩增引物与数据集a中3条vann基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少4个错配，说明：(1)本发明所采用的引物组5所含的vann基因扩增引物可涵盖迄今为止已发现的所有vann基因及其突变基因，具有高度的vann基因涵盖性；(2)本发明所采用的引物组5所含的vann基因扩增引物对vanc、vane、vang和vanl基因，以及与vann基因相似的其他基因，无法有效扩增，具有高度的vann基因特异性。

本发明所采用的探针5所含的vann基因特异性探针序列与数据集a中3条vann基因比对序列完全匹配，而与数据集a中其他基因比对序列，以及数据集b中的所有序列均存在至少3个错配，说明：(1)本发明所采用的探针5所含的vann基因特异性探针可涵盖迄今为止已发现的所有vann基因及其突变基因，具有高度的vann基因涵盖性；(2)本发明所采用的探针5所含的vann基因特异性探针对vanc、vane、vang和vanl基因，以及与vann基因相似的其他基因，无法有效杂交，具有高度的vann基因特异性。

实施例2、本发明所述的特异性引物探针组合的检测特异性

本实施例所用的引物和探针，均由上海英骏生物技术有限公司合成。

一、待测样本的制备

本实施例以分别包含五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann的质粒dna为待测样本，检验本发明所述的引物探针组合的检测特异性。

上述各质粒的制备方法如下：

待测样本1为包含耐药基因vanc的质粒：将puc18质粒的hindiii和bamhi位点之间的序列替换为vanc基因参考序列af162694所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vanc的质粒；

待测样本2包含耐药基因vane的质粒：将puc18质粒的sali和kpni位点之间的序列替换为vane基因参考序列fj872411所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vane的质粒；

待测样本3包含耐药基因vang的质粒：将puc18质粒的hindiii和ecori位点之间的序列替换为vang基因参考序列dq212986所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vang的质粒；

待测样本4包含耐药基因vanl的质粒：将puc18质粒的hindiii和ecori位点之间的序列替换为vanl基因参考序列eu250284所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vanl的质粒；

待测样本5包含耐药基因vann的质粒：将puc18质粒的hindiii和ecori位点之间的序列替换为vann基因参考序列jf802084所示的序列，得到重组质粒，该质粒即为包含耐药基因vann的质粒；

待测样本6为质粒puc18，不包含vanc、vane、vang、vanl和vann基因中的任何一种，为阴性对照。

上述质粒均通过测序，确定了序列如上所述。

二、引物组合的配制

本发明所述的引物组合包括引物组1-5，分别用于检测vanc、vane、vang、vanl和vann基因。

本实施例所用的引物是在本发明所述的特异性引物组中的反向引物序列(即序列2、4、6、8、10)的5’-末端加上一段与待测基因完全没有同源性的无关序列(本实施例采用的是来源于模式植物拟南芥的序列片段)，并标记荧光分子。使得反向引物在pcr扩增过程中的较高退火温度下仍可以继续扩增，并使得扩增产物单链末端携带荧光分子，该单链产物与特异性探针杂交后，使得特异性探针所在位置显示出荧光。

本实施例所用的引物序列如下：

用于检测vanc基因的引物组1包括(5’-3’)：

正向引物(序列1)：

gttcgcaatgatacttggct；

反向引物(序列2修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-ccatacttcccatgcaagac；

用于检测vane基因的引物组2包括(5’-3’)：

正向引物(序列3)：

cagttgcgattatctttggc；

反向引物(序列4修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-tccgataccacaacctacat；

用于检测vang基因的引物组3包括(5’-3’)：

正向引物(序列5)：

ataaactcgttagccttgcg；

反向引物(序列6修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-ccgcttcttgtatccgtttt；

用于检测vanl基因的引物组4包括(5’-3’)：

正向引物(序列7)：

aggatgctttaacagaagcg；

反向引物(序列8修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-cctgaacagcctagtaacct；

用于检测vann基因的引物组5包括(5’-3’)：

正向引物(序列9)：

gggttttatgaccaagcaga；

反向引物(序列10修饰后)：

tamra-cgcggcgtgctgtggtgtttggtg-tgtaggcgtactcatcactc；

本实施例对本发明所述的特异性引物进行上述修饰，目的是提升pcr扩增产物中与本发明所述的特异性探针杂交的负链产生效率，提升检测灵敏度；标记荧光分子是为了使结果可视化，数据化。上述修饰对所述的引物特异性并无影响，为本领域常见技术，并且为达到上述目的的方式不止本实施例所采用的这一种。其他不影响本发明所述的引物特异性的改进方式，均可以与本发明所述的特异性引物结合应用。

本发明所述的引物组合中，所述引物组1、2、3、4、5的摩尔比为1:1.5:1.5:1:1。

上述引物组1、2、3、4、5可分别配制成较高浓度的母液，单独包装；也可按照摩尔比混合配制成较高浓度的溶液。使用时与pcr扩增反应液混合，再加入模板dna后进行pcr扩增反应。本实施例中，配制成4倍终反应浓度的引物混合物溶液备用。

三、探针的配制

本实施例所用的特异性探针是在本发明所述的特异性探针序列(即序列11-15)的5’-末端连接上25个碱基t，并在末端进行化学修饰。

本实施例所用的探针序列(5’-3’)如下：

用于检测vanc基因的探针1(序列11修饰后)：

nh2-poly(t)25-caccagctgactttttctagcca；

用于检测vane基因的探针2(序列12修饰后)：

nh2-poly(t)25-tgagaatggtgctatgcaggga；

用于检测vang基因的探针3(序列13修饰后)：

nh2-poly(t)25-tgttcgtgcaggctcttcct；

用于检测vanl基因的探针3(序列14修饰后)：

nh2-poly(t)25-ttggctgtgctgtcttaggt；

用于检测vann基因的探针4(序列15修饰后)：

nh2-poly(t)25-acacggtggcactggagaaa。

本实施例对本发明所述的特异性探针进行上述修饰，目的是使特异性探针可以通过化合键(nh2-)固定在本实施例采用的载体(醛基化基片)上；以及通过增加探针长度(poly(t)25)加大杂交反应的空间范围，抵消空间位阻对杂交效率的影响。上述修饰对本发明所述的探针特异性并无影响，为本领域常见技术，并且为达到上述目的的方式不止本实施例所采用的这一种。其他不影响本发明所述的探针特异性的改进方式，如：其他化学基团的修饰、其他类型的探针载体(硝酸纤维素膜)等，均可以与本发明所述的探针结合应用。

采用genemachine点样仪，将上述特异性探针分别溶解在50％(v/v)dmso溶液中(探针浓度为10μm)。按图1所示的探针点阵排布方式将溶解后的探针点制在醛基修饰的基片(光学级醛基基片，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：420022)上(每点用量约为0.44nl)，干燥并固定后，贴上12样品围栏(smartgrid^tm，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：430033)，制成检测五种糖肽类药物耐药基因的芯片，备用。

图1中所示的hybpcp3为杂交阳性对照探针，其使用目的是监测杂交反应的正常与否。其序列选自与本发明检测的目标物种(细菌)亲缘关系极远的植物(拟南芥)的基因序列(5’-gcaaccaccaccggagg)，对本发明所述的探针特异性并无影响。其他与本发明所述的探针特异性无关的序列均可采用。在杂交反应中设置对照品是本领域的常规做法，其他可起到同样目的的对照品设置方式，均可以与本发明所述的探针结合应用。

图1中的“7”是与本发明无关的其他耐药基因的探针。

四、待测样本的检测

步骤1：用本发明所述的特异性引物组对待测样品进行pcr扩增

分别以步骤一制备的6种质粒dna为模板，将步骤二配制的4倍终反应浓度的引物混合物与商品化的2×pcr反应液，及质粒dna模板混合后进行pcr扩增。

单个pcr反应体系为：将2×pcr反应液(天根公司产品号：kt201)10μl、4×引物混合物5μl和1μl质粒dna(10-100ng/μl)混合，补水至20μl。反应体系中，引物组1、4、5的终浓度为0.1μm，引物组2、3的终浓度为0.15μm。6种质粒分别进行检测，共配制6个pcr反应体系。

pcr扩增反应在dnaenginetetrad2(bio-rad)热循环仪上进行，采用以下热循环程序：94℃预变性3min→94℃变性30sec；48℃复性30sec；72℃延伸45sec，循环20次→95℃变性30sec；58℃复性30sec；72℃延伸45sec，循环20次→72℃延伸7min→冷却至16℃。

步骤2：用本发明所述的特异性探针与步骤1获得的pcr产物进行杂交

取扩增后的pcr产物，与杂交反应液混合后进行杂交反应。

单份杂交反应体系的配制如下(根据样品数量进行体系放大)：取步骤1获得的pcr扩增产物11.5μl，与20×sspe(生工公司，产品号b548111-0200)3.75μl、4％(w/v，即4g/100ml)sds(生工公司，产品号b548118-0100)1.25μl、50×denhardt's(生工公司，产品号b548209-0050)2.5μl、100％(v/v)去离子甲酰胺(生工公司，产品号a600211-0100)5μl和杂交阳性对照(1nm)1μl混合，6种pcr扩增产物分别进行检测，共配制6个杂交反应体系。

本实施例在上述杂交反应液中使用的杂交阳性对照品，是与前述的交阳性对照探针hybpcp3互补的，带有荧光分子标记的寡核苷酸，序列为：tamra-cctccggtggtggttgc。其使用目的是与hybpcp3探针杂交，以监测杂交反应的正常与否。如前所述，其使用对本发明所述的探针特异性并无影响。其他与本发明所述的探针特异性无关的杂交阳性对照品均可采用。在杂交反应中设置对照品是本领域的常规做法，其他可起到同样目的的对照品设置方式，均可以与本发明所述的探针结合应用。

将制备好的五种糖肽类药物耐药基因检测芯片和盖片(smartcover^tm，北京博奥生物芯片有限责任公司，产品号：430044)放置于杂交盒内。针对每一份待测样品，取20μl已配制好的杂交反应体系，加样后封闭好杂交盒，置于32℃杂交2小时。杂交结束后，取出芯片，置于洗液(2×ssc和0.2％sds)中，室温摇洗5分钟；之后将芯片用去离子水漂洗5分钟后，离心甩干。

步骤3：检测结果采集及分析

芯片上的荧光信号采用genepix4200al激光共聚焦扫描仪及其配套软件genepixpro.6.0(axoninc.)扫描采集。扫描参数如下：激发光波长：532nm；laserpower：33％；pmt：400。

用genepixpro6.0软件提取每个探针信号点的杂交信号，计算每一个探针信号点的信噪比(signalnoiseratio，snr＝(信号值-背景值)/背景值)，从而确定样品中糖肽类药物耐药基因类型，提示耐药性。当信噪比大于等于3时，判定该探针所对应的基因检测结果为阳性，如所有特异性探针信噪比均小于3，则判定该待测样品中不包含待测的五种糖肽类药物耐药基因。

本实施例中，6种待测样品的检测结果如图2所示。

结果显示，针对待测样本1，即包含耐药基因vanc的质粒，仅特异性探针1(序列11)杂交结果为阳性，显示样品中包含vanc耐药基因；针对待测样本2，即包含耐药基因vane的质粒，仅特异性探针2(序列12)杂交结果为阳性，显示样品中包含vane耐药基因；针对待测样本3，即包含耐药基因vang的质粒，仅特异性探针3(序列13)杂交结果为阳性，显示样品中包含vang耐药基因；针对待测样本4，即包含耐药基因vanl的质粒，仅特异性探针4(序列14)杂交结果为阳性，显示样品中包含vanl耐药基因；针对待测样本5，即包含耐药基因vann的质粒，仅特异性探针5(序列15)杂交结果为阳性，显示样品中包含vann耐药基因；针对待测样本6，即阴性对照质粒puc18，所有特异性探针杂交结果为阴性。显示本发明所述的特异性引物和探针组合对vanc、vane、vang、vanl和vann基因有极强的检测特异性。

实施例3、用本发明所述的特异性引物探针组合检测肠球菌菌株

本实施例对已收集的糖肽类药物耐药菌株，具体为万古霉素耐药的粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)进行了vanc、vane、vang、vanl和vann耐药基因的检测，以说明本发明提供的特异性引物探针组合可用于检测糖肽类药物耐药菌株中上述五种耐药基因的检测。

具体如下：

一、待测样品

由于本发明所涉及的五种糖肽类药物耐药基因vanc、vane、vang、vanl和vann在肠球菌中的分布，相较于vana、vanb耐药基因而言，较为少见，其中vane、vanl和vann基因分离率更低。通过分离菌株的方式收集包含上述五种糖肽类药物耐药基因的菌株，需要耗费大量的时间和材料成本，并且仍有可能是可遇而不可求。而通过向已报道相关糖肽类药物耐药基因的实验室，索取非商业用途的菌株或克隆，也有可能带来耐药基因的扩散问题，导致相关药物治疗无效情况的扩散，也很难成功。有鉴于此，本实施例用本发明所述的特异性引物探针组合，分别对已收集的部分万古霉素耐药粪肠球菌和屎肠球菌菌株，以及万古霉素敏感菌株进行了检测，说明本发明所述的特异性引物探针组合，可用于待测样品中相关耐药基因的检测。

经测序确认，样品ecc013和ecc117包含vanc基因，样品ecc187包含vang基因，样品ecc042和ecc085为糖肽类药物敏感菌株，不包含任何待检测的五种糖肽类药物耐药基因。

对上述粪肠球菌和屎肠球菌菌株，采用qiagene公司dneasyblood&tissuekit(产品号：69506)提取细菌全基因组核酸。

二、引物组合的配制

本实施例使用的引物组合配制方法和步骤同实施例2。

三、探针的配制

本实施例使用的探针组合配制方法和步骤同实施例2。

四、待测样本的检测

步骤1：用本发明所述的特异性引物组对待测样品进行pcr扩增

方法及步骤同实施例2。仅将pcr扩增体系中的模板由质粒dna替换为从上述待测菌株中提取的细菌全基因组核酸(浓度为200ng/μl左右)。

步骤2：用本发明所述的特异性探针与步骤1获得的pcr产物进行杂交。

方法及步骤同实施例2。

步骤3：检测结果采集及分析

方法及步骤同实施例2。

待检样品经本发明所述的特异性引物组合扩增，并与本发明所述的特异性探针杂交后，经过信号提取，上述待检样品的信噪比计算结果如下表2所示。

表2

针对样品ecc013和ecc117，仅vanc特异性探针(序列11)杂交结果为阳性，显示样品ecc013和ecc117中包含vanc耐药基因；针对样品ecc187，仅vang特异性探针(序列13)杂交结果为阳性，显示样品ecc187中包含vang耐药基因；针对样品ecc042和ecc085，无特异性探针杂交结果为阳性，显示样品ecc042和ecc085中不包含任何待测的五种糖肽类药物耐药基因。

所有待测样品的检测结果与测序结果完全一致，且特异性探针与且仅与包含探针所对应耐药基因的样品产生阳性信号，而与其他基因pcr扩增产物之间均没有非特异性杂交，显示出极高的探针特异性，说明本发明提供的特异性引物探针组合适用于分离菌株中五种糖肽类药物耐药基因的检测。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>检测肠球菌属细菌中五种糖肽类药物耐药基因的特异性引物和探针组合及应用

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ccatacttcccatgcaagac20

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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