Hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用、组合物及试剂盒的制作方法

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用、增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物及包括该组合物的试剂盒。

背景技术：

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)是分子生物学中一种核酸扩增的重要技术手段，已广泛用于临床的疾病诊断和预防中。pcr检测结果的准确性和准确度主要由扩增特异性、灵敏度和扩增效率等三项技术指标决定，为了改善pcr的扩增效果，研究人员通常设法提高该三方面的技术指标，以提高pcr临床检测的可靠性。在上述三项的技术指标中，显著的扩增特异性是高灵敏度和高扩增效率的前提，也是改善pcr检测准备性的主要研究方向。

在pcr技术发明初期，为了提高pcr的扩增特异性，在pcr循环开始，反应液加热到变性温度时加入dna聚合酶，以此方法改善pcr特异性，随着技术的进步，逐渐发展到石蜡物理分隔反应组分、抗体修饰dna聚合酶、化学修饰dna聚合酶、修饰引物等等方法加以实现，在一定程度上提高了pcr扩增特异性，改善了扩增效果，但在一些情况下仍然存在非特异性扩增。

针对dna聚合酶进行着手以提高pcr扩增特异性，为目前最常用的提高pcr特异性方法，包括化学修饰dna聚合酶和在反应体中加入dna聚合酶抗体。pcr中出现非特异性扩增的原因主要由于dna聚合酶在较低的温度下，如室温，仍然具有较强的活性，导致在反应体系配制过程和进入pcr循环的退火阶段中，引物之间或者引物与模板非目的序列进行配对，经过pcr循环后，非目的序列获得大量扩增，出现了明显的副产物。利用化学方法，对dna聚合酶进行修饰，可封闭dna聚合酶活性，避免了反应体系配制过程中出现扩增反应，从而减少非特异产物产生；同理，dna聚合酶抗体同样也可封闭dna聚合酶活性，以防止非特异产物产生，同样可改善pcr的扩增特异性。但是，上述两种方法对dna聚合酶活性封闭不彻底，仍然存在一定程度的非特异性扩增，而且上述两种方法dna聚合酶的制备工艺复杂，生产条件苛刻，成本较高，进一步限制其应用。

因此，仍需要一种方法进一步提高pcr的扩增特异性，以进一步提高pcr的检测准确性。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种能够增强聚合酶链式反应扩增特异性的hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用、增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物及试剂盒。

hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用，hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，以增强聚合酶链式反应扩增特异性。此外，hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，还能够提高pcr的反应速率，提高pcr目标产物的产量。

在其中一个实施例中，hel112解旋酶在pcr的反应体系中的浓度为0.001ng/μl至10ng/μl。

在其中一个实施例中，hel112解旋酶在pcr的反应体系中的浓度为1ng/μl至4ng/μl。

在其中一个实施例中，所述hel112解旋酶的氨基酸序列为seqidno.1。

在其中一个实施例中，hel112解旋酶为ssohel112解旋酶。

一种用于增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物，所述组合物包括hel112解旋酶，hel112解旋酶用于添加至pcr的反应体系中，以增强聚合酶链式反应扩增特异性。

在其中一个实施例中，所述hel112解旋酶的表达基因的碱基序列为seqidno.2。

在其中一个实施例中，所述hel112解旋酶的制备方法包括如下步骤：

将hel112解旋酶的表达基因插入到大肠杆菌表达载体pet28a的nhei/bamhi位点，构建质粒pet28a-hel112；

将质粒pet28a-hel112转化到rosetta大肠杆菌宿主菌中；

将rosetta大肠杆菌宿主菌置于含有氯霉素和卡那霉素的培养基中进行培养，

向培养基中加入iptg以诱导培养制备得到所述hel112解旋酶。

在其中一个实施例中，所述向培养基中加入iptg以诱导培养制备得到所述hel112解旋酶，具体为：

向培养基中加入iptg以诱导培养；

收集诱导培养后的rosetta大肠杆菌宿主菌，buffera冲悬，破碎细胞；

离心取上清，80℃保温20分钟，离心取上清，上清加载至buffera平衡的ni层析柱，buffera洗涤层析柱后，25mm-500mm咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱峰；收集的样品于buffera透析；透析后的样品加载于含heparinsepharose介质的层析柱，用buffera洗涤层析柱，100mm-1mkcl进行梯度洗脱，收集洗脱峰，制得所述hel112解旋酶的溶液。

在其中一个实施例中，在制得所述hel112解旋酶的溶液之后，所述hel112解旋酶的制备方法包括如下步骤：将所述hel112解旋酶的溶液冷冻干燥制备得到hel112解旋酶的干燥粉。

一种pcr试剂盒，其特征在于，包括如上任一实施例中所述的用于增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物。

上述hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用，通过将hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，能够增强聚合酶链式反应扩增特异性。此外，hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，还能够提高pcr的反应速率，提高pcr目标产物的产量。

附图说明

图1为一实施例的hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用后的电泳图。

具体实施方式

为了便于理解本申请，为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，附图中给出了本申请的较佳实施方式。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请的公开内容理解的更加透彻全面。本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

一实施例中，hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用，hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，以增强聚合酶链式反应扩增特异性。此外，hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，还能够提高pcr的反应速率，提高pcr目标产物的产量。上述hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用，通过将hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，能够增强聚合酶链式反应扩增特异性。此外，hel112解旋酶添加至pcr的反应体系中，还能够提高pcr的反应速率，提高pcr目标产物的产量。一实施例中，所述hel112解旋酶的氨基酸序列为seqidno.1。一实施例中，所述hel112解旋酶的表达基因的碱基序列为seqidno.2。一实施例中，hel112解旋酶在pcr的反应体系中的浓度为0.001ng/μl至10ng/μl。一实施例中，hel112解旋酶在pcr的反应体系中的浓度为0.001ng/μl至4ng/μl。再如，hel112解旋酶在pcr的反应体系中的浓度为1ng/μl至4ng/μl。再如，hel112解旋酶在pcr的反应体系中的浓度为2ng/μl至4ng/μl。

需要说明的是，在聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)后，跑胶时pcr出现非特异条带，主要因素在两方面：一、在反应体系配制过程，引物之间进行配对，在dna聚合酶的作用下，配对的引物开始延伸，合成了小片段的非目的片段，并经过pcr循环，非目的片段发生了指数级别扩增，产生了大量的非特异dna；二、在pcr循环的退火阶段，引物与模板的非目的序列发生错配，在dna聚合酶的合成作用下开始延伸，产生了非特异片段，同样的，经过pcr循环后，非特异片段进行了大量扩增，产生了大量的非目的产物。由此可见，非特异产物的出现是由于在引物之间或引物与模板之间的错配。因此，引导引物正确配对，可极大的提高pcr扩增的特异性。研究发现(feliceetal,2007)，来源于古细菌sulfolobussolfataricus(硫磺矿硫化叶菌)热稳定的dna解旋酶hel112具有促进单链dna退火的活性。本申请试图将其添加至pcr反应体系，看其是否能够引导引物与目标序列退火，是否能够提高聚合酶链式反应扩增特异性。后续经试验证实，发现通过添加hel112解旋酶，能够显著改善pcr扩增特异性，此外，还意外地发现，其提高了pcr的反应效率。

一实施例中，所述hel112解旋酶通过hel112解旋酶的制备方法制备得到。当然，若hel112解旋酶有市售产品时，hel112解旋酶也可以通过采购市售产品进行实现。一实施例中，所述hel112解旋酶的制备方法包括如下步骤：将hel112解旋酶的表达基因插入到大肠杆菌表达载体pet28a的nhei/bamhi位点，构建质粒pet28a-hel112；将质粒pet28a-hel112转化到rosetta大肠杆菌宿主菌中；将rosetta大肠杆菌宿主菌置于含有氯霉素和卡那霉素的培养基中进行培养，向培养基中加入iptg(isopropylβ-d-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)以诱导培养制备得到所述hel112解旋酶。本实施例中，表达得到的hel112解旋酶即为ssohel112解旋酶。

又一实施例中，所述hel112解旋酶的制备方法中，所述向培养基中加入iptg以诱导培养制备得到所述hel112解旋酶，具体为：

向培养基中加入iptg以诱导培养；

收集诱导培养后的rosetta大肠杆菌宿主菌，buffera冲悬，破碎细胞；

离心取上清，80℃保温20分钟，离心取上清，上清加载至buffera平衡的ni层析柱，buffera洗涤层析柱后，25mm-500mm咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱峰；收集的样品于buffera透析；透析后的样品加载于含heparinsepharose介质的层析柱，用buffera洗涤层析柱，100mm-1mkcl进行梯度洗脱，收集洗脱峰，制得所述hel112解旋酶的溶液。

又一实施例中，在制得所述hel112解旋酶的溶液之后，所述hel112解旋酶的制备方法包括如下步骤：将所述hel112解旋酶的溶液冷冻干燥制备得到hel112解旋酶的干燥粉。

上述hel112解旋酶的制备方法，能够较好地制备得到hel112解旋酶。

本发明还提供一种用于增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物，所述组合物包括hel112解旋酶，组合物用于添加至pcr的反应体系中，以增强聚合酶链式反应扩增特异性和提高pcr的反应速率。再如，组合物中，hel112解旋酶的浓度为50ng/μl。需要说明的是，组合物可以配置液体制剂，如此，使用时根据需要加入适当的体积即可。

本发明还提供一种pcr试剂盒，其特征在于，包括如上任一实施例中所述的用于增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物。组合物用于添加至pcr的反应体系中，提高pcr的反应速率，提高pcr目标产物的产量。需要说明的是，pcr试剂盒中除了包括hel112解旋酶外，还可以包含有其它pcr体系的物质，如buffer、dntp、taqdna聚合酶等。

下面结合具体实施例对本申请予以说明。

实施例一：从大肠杆菌中提取ssohel112解旋酶

根据hel112解旋酶基因(seqidno.1)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，在hel112解旋酶基因5’端和3’端分别加入nhei和bamhi酶切位点，即在5’端加入nhei酶切位点，在3’端加入bamhi酶切位点。将合成的hel112解旋酶基因插入至大肠杆菌表达载体pet28a的nhei/bamhi位点，构建的质粒命名为质粒pet28a-hel112。将质粒pet28a-hel112转化大肠杆菌rosetta细胞中。带有质粒pet28a-hel112的rosetta细菌于5l含有30ug/ml氯霉素和100ug/ml卡那霉素的lb培养基进行培养，当培养液od600为0.8时，加入iptg至iptg终浓度为0.2mm，继续培养2小时。收集细菌，即收集诱导培养后的rosetta大肠杆菌宿主菌，加入50mlbuffera重悬，其中，buffera包括：25mmtris/hcl(ph8.0)，2.5mmmgcl2，100mmkcl和15％甘油；破碎细胞，离心取上清，80℃保温20分钟，离心取上清，上清加载至buffera平衡的ni层析柱，buffer洗涤层析柱后，25mm-500mm咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱峰。收集的样品于buffera透析过夜。透析后的样品加载于含heparinsepharose(肝素琼脂糖凝胶)介质的层析柱，用buffera洗涤层析柱，100mm-1mkcl进行梯度洗脱，收集洗脱峰，制得所述hel112解旋酶的溶液，即为ssohel112解旋酶的溶液。收集的样品储存于4℃备用。需要说明的是，本申请的单位“m”即为摩尔/升，本申请的单位“mm”即为毫摩尔/升，下同。需要说明的是，buffera中的15％甘油即为buffera中含有体积分数为15％的甘油。

实施例二、hel112解旋酶蛋白增强聚合酶链式反应扩增特异性

将实施例一制备的hel112解旋酶蛋白分别按0ng、50ng、100ng和200ng不同用量加入pcr反应体系，观察不同的hel112解旋酶蛋白用量对pcr扩增特异性的影响，按下表配制pcr反应体系：

表1pcr反应体系

其中，*10×pcrbuffer配方如下：100mmtris-hcl(ph8.3)，500mmkcl，15mmmgcl2。上游引物的序列如seqidno.3；下游引物的序列如seqidno.4。本申请人类dna序列如seqidno.5。上游引物的序列为tctctgtccttccctagctct。下游的引物序列为tccttggacagccgtgcc。扩增的dna序列，即扩增的人类dna序列为：tctctgtccttccctagctcttttatatagagacagagagatggggtctcactgtgttgcccaggctggtcttgaacttctgggctcaagcgatcctcccgcctcggcctcccaaagtgctgggattagaggcatgagccaccttgcccggcctcctagctccttcttcgtctctgcctctgccctctgcatctgctctctgcatctgtctctgtctccttctctcggcctctgccccgttccttctctccctcttgggtctctctggctcatccccatctcgcccgccccatcccagcccttctccccgcctcccactgtgcgacaccctcccgccctctcggccgcagggcgctgatggacgagaccatgaaggagttgaaggcctacaaatcggaactggaggaacaactgaccccggtggcggaggagacgcgggcacggctgtccaagga。

pcr循环设置如下：95℃，5min；95℃，1min；60℃，1min；40cycles；72℃，1min。即，本pcr的循环次数为40个循环。

将上述反应体系置于pcr仪反应，反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为：恒定电压180伏，时间为20min。marker为：100bpdnaladder。实验结果如图1所示。

其中图1的m为marker，100bpdnaladder，图1中条带大小自上而下分别为：1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp。

其中图1中的列标题1-2，为加入了50ng的hel112解旋酶蛋白。换算到pcr反应体系中，其hel112解旋酶蛋白的添加浓度为1ng/μl。

其中图1中的列标题3-4：为加入了100ng的hel112解旋酶蛋白。换算到pcr反应体系中，其hel112解旋酶蛋白的添加浓度为2ng/μl。

其中图1中的列标题5-6：为加入了200ng的hel112解旋酶蛋白。换算到pcr反应体系中，其hel112解旋酶蛋白的添加浓度为4ng/μl。

其中图1中的列标题7-8：为加入了0ng的hel112解旋酶蛋白，即未加入hel112解旋酶蛋白作为空白对照。

由图1可以看出，相对于空白对照7-8，通过加入hel112解旋酶蛋白，能够明显提高pcr反应的扩增特异性，减少非目标产物的产量。此外通过对比图1中的1至6可以看出，在实验范围内，随着hel112解旋酶蛋白用量的增加，即从1ng/μl提高至4ng/μl，对pcr的扩增特异性和提高反应速率都相应提高。而具有显著作用的为3-4和5-6。即，hel112解旋酶蛋白在pcr反应体系中的添加用量为2ng/μl至4ng/μl，pcr的扩增特异性和提高反应速率提高较为显著。而在5-6中的hel112解旋酶蛋白在pcr反应体系中的添加用量为4ng/μl时，其为最优，跑出来的条带单一，表明其能够较好地提高pcr的扩增特异性和能够较好地提高反应速率。

本发明发现热稳定的具有促进行单链dna退火活性的hel112解旋酶蛋白能有效地提高聚合酶链式反应(pcr)特异性，从而发明一种的改善pcr扩增效果的新方法。表明hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用能够较好地提高pcr的扩增特异性和能够较好地提高反应速率。由此，本发明提供一种用于增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物，所述组合物包括hel112解旋酶。本发明还提供一种pcr试剂盒，包括上述用于增强聚合酶链式反应扩增特异性的组合物。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。需要说明的是，本申请的“一实施例中”、“例如”、“又如”等，旨在对本申请进行举例说明，而不是用于限制本申请。以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>深圳市刚竹医疗科技有限公司

<120>hel112解旋酶在聚合酶链式反应中的应用、组合物及试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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