miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用的制作方法

本发明涉及细胞工程和基因工程技术领域，尤其涉及一种mir-26a调节生殖细胞凋亡的应用。

背景技术：

在哺乳动物卵巢中，卵泡发生和闭锁过程受到复杂的基因网络的严格调控。因此，可以同时来源于细胞和细胞外来源的mirna通过广泛参与转录后的mrna调节而起到介导这些过程的作用。已有研究表明，卵巢mirna在卵泡和黄体发育、卵巢功能和卵巢疾病和内分泌紊乱方面起着重要作用，mirna通过促进颗粒细胞凋亡和抑制凋亡来发挥调控作用。

据报道，mir-26b参与了动物繁殖的调控，mir-26b通过靶向smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡，mir-26a与mir-26b具有相同的种子序列，因此，mir-26a可能在卵巢颗粒细胞中也发挥相似作用。有学者通过分析mirna在卵泡发育过程中表达模式，筛选和鉴定相关mirna、mrna和通路，发现smad2是调节牛卵泡发育的中枢因子，并且进一步研究发现mir-26a/b调控smad2基因发挥作用。

这些研究结果表明，mir-26a在卵泡发育过程中可能起着重要的调控作用，但目前mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中的研究还未见相关报道。

技术实现要素：

本发明提出一种mir-26a调节生殖细胞凋亡的应用。

优选地，mir-26a的核酸序列如seq.no.1所示。

优选地，生殖细胞为哺乳动物的生殖细胞；优选地，生殖细胞为猪的生殖细胞；优选地，生殖细胞为卵巢颗粒细胞。

优选地，mir-26a调控seladin-1基因的表达来调节生殖细胞凋亡；优选地，mir-26a调控2,4-脱氢胆固醇还原酶来调节生殖细胞凋亡。

优选地，mir-26a调控smad4基因的表达来调节生殖细胞凋亡。

seladin-1基因与编码dhcr24酶的基因是一样的，后统一命名为2,4-脱氢胆固醇还原酶(dhcr24，又称seladin-1)。dhcr24蛋白的抗凋亡作用与抑制caspase-3的激活有关，如神经细胞和其他细胞模型所示。进一步的研究表明，dhcr24具有清除剂活性，从而保护细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡，即dhcr24具有活性氧清除活性。这些研究表明，dhcr24对许多细胞类型具有抗凋亡活性。因此，dhcr24是一种同时具有胆固醇合成和抗凋亡活性的多功能蛋白。

虽然已有研究表明，dhcr24在卵巢中有表达，但在卵泡发育及颗粒细胞功能调控方面研究还尚不清楚。而刘吉英(刘吉英.mir-26b调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制[d].南京农业大学,2016)揭露了mir-26b通过靶向smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡，而mir-26a与mir-26b具有相同的种子序列，即mir-26a可能在卵巢颗粒细胞中也发挥相似作用，但相关研究还较少，目前mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中的研究还未见相关报道。

本发明公开了dhcr24和smad4是mir-26a的靶基因，在猪卵巢颗粒细胞中，mir-26a在转录水平和翻译水平负调控dhcr24和smad的表达；mir-26a通过干扰dhcr24和smad4表达从而促进卵巢颗粒细胞凋亡，同时再通过调节类固醇合成通路影响激素分泌控制雌二醇、孕酮分泌。

附图说明

图1为双荧光素酶报告检测中gp-mirglo质粒图谱信息。图2为mir-26a与dhcr24的3’utr区域结合图。图3为mir-26a与smad4的3’utr区域结合图。图4为qpcr检测mir-26a小片段转染效率图。图5为mir-26a促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。图6为mir-26a对雌二醇、孕酮分泌的影响图。图7为smad4-wt比对结果图。图8为smad4-mut比对结果图。图9为dhcr24-wt比对结果图。图10为dhcr24-mut比对结果图。图11为实施例6的双荧光素酶活性检测图。图12为qpcr验证mir-26a转录水平调控靶基因表达图。图13为westernblot验证mir-26a对靶基因蛋白水平的影响图。图14为qpcr检测si-dhcr24、si-smad4干扰效率图。图15为干扰dhcr24对颗粒细胞凋亡的影响图。图16为干扰smad4对颗粒细胞凋亡的影响图。图17为干扰靶基因对雌二醇、孕酮的影响图。

具体实施方式

mir-26a模拟物(mir-26amimic)、模拟物阴性对照(mimicnc)、mir-26a抑制物(mir-26ainhibitor)、抑制物阴性对照(inhibitornc)、smad4干扰rna(si-smad4)、dhcr24干扰rna(si-dhcr24)干扰rna阴性对照(nc-sirna)均由广州市锐博科技生物有限公司合成，核酸序列如下：

注：dhcr24-sirna序列为靶序列；nc-sirna由广州锐博科技生物有限公司合成，其序列保密。

实施例1生物信息学预测及保守性分析

在mirbase数据库(http://www.mirbase.org/)下载猪(susscrofa)、人(homosapiens)、小鼠(musmusculus)、牛(bostaurus)、山羊(caprahircus)、猴(macacamulatta)、马(equuscaballus)、大鼠(rattusnorvegicus)、斑马鱼(daniorerio)、鸡(gallusgallus)10个物种的mir-26a成熟序列，使用mega6.0软件分析其保守性。不同物种中mir-26a成熟序列比对如下表所示(其下表中虚线框内为种子序列)：

由上表可知：mir-26a的成熟序列在哺乳动物及斑马鱼中序列完全一致，具有22个碱基，鸡仅仅5‘端少一个碱基u，表明mir-26a在脊椎动物中具有较高的保守性。

根据ncbi数据库查询猪dhcr24、smad4mrna序列信息，其3’utr长度分别为2649bp、1315bp。根据本申请人前期对猪卵泡期和黄体期卵巢进行转录组及mirna测序分析(详见田密.约克夏猪卵巢黄体期到卵泡期转变的关键mirna的筛选与功能分析[d].安徽农业大学,2018；张旭.猪卵巢卵泡期和黄体期的转录组特征及差异基因筛选[d].安徽农业大学,2018)，以及对猪高低产仔猪卵巢转录组及小rna高通量测序分析(详见黄龙.基于卵巢rna组学鉴定影响猪产仔数性状的候选基因及microrna[d].安徽农业大学,2016.)，发现mir-26a可能与dhcr24、smad4存在靶向关系。通过rnahybird(bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测可知，dhcr24和smad4可能是mir-26a调控的基因，预测结果如图2和图3，图2为mir-26a与dhcr24的3’utr区域结合图，图3为mir-26a与smad4的3’utr区域结合图。

实施例2引物设计与合成

从最新的mirbase22.1数据库(www.mirbase.org)中查询并下载ssc-mir-26a(序列号：mi0002429)的成熟序列。利用加尾法设计mirna引物，下游引物为通用引物由tipgreenmirnatwo-stepqrt-pcrsupermix试剂盒提供。

从ncbi数据库，下载猪基因smad4(geneid：397142)、dhcr24(geneid：100628197)、caspase-3(geneid：397244)、bcl-2(geneid：100049703)的mrna序列。使用primerpremier6.0软件对这几个基因的mrna进行引物设计，使用ncbi平台中primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？link_loc＝blasthome)对设计的引物进行序列比对及特异性分析。

smad4、dhcr24、bcl-2、caspase-3、mir-26a及内参基因β-actin和u6引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成，具体引物信息见下表(注：f为上游引物；r为下游引物。mir-26a和u6为上游特异性引物，下游引物为通用引物，由试剂盒内提供)：

实施例3猪卵巢颗粒细胞分离培养、接种转染

原代培养：(1)将猪卵巢置于预热的37℃生理盐水(添加1％双抗)中，迅速运回实验室；(2)将卵巢用预热的pbs(含1％双抗)清洗3遍，用1ml无菌注射器抽取直径3～6mm中等大小卵泡中的卵泡液；(3)吸取的卵泡液置于5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm，室温离心5min；(4)弃上清，用完全培养基重悬，1000rpm离心5min，重复2次；(5)弃上清，用适量完全培养基重悬，接种于10cm细胞培养皿中；(6)置于37℃，5％co2培养箱中培养，48h后观察贴壁情况，去除培养基；(7)加入10ml预热pbs清洗；(8)更换完全培养基，继续培养至细胞汇合度达到90％左右，进行传代培养。

传代培养：(1)弃去培养皿中的培养基，用预热过的pbs清洗2遍；(2)加入3ml含0.25％edta的胰蛋白酶，轻晃使其与贴壁细胞充分接触；(3)置于培养箱中孵育2～3min，显微镜下观察至大部分细胞漂起即可；(4)立即加入6ml完全培养基终止消化，轻吹打数次；(5)转移至15ml离心管中，1000rpm，离心5min；(6)弃上清，加入5ml完全培养基重悬细胞，1000rpm，离心5min，重复2次；(7)加入适量完全培养基重悬细胞，接种于10cm培养皿；(8)放置37℃，5％co2培养箱中培养，24h后观察细胞生长状况。

接种转染：(1)待10cm培养皿中细胞汇合度达到80～90％时，细胞接种前处理方法中传代培养方法；(2)使用完全培养基重悬细胞，均匀分配到每个孔中，加入完全培养基至合适体积，轻轻摇匀，置于培养箱中培养；(3)24h后，观察细胞状况，汇合度70～80％左右准备进行转染；(4)按照德国qiagen公司hiperfecttransfectionreagent转染试剂说明书进行；每组设置3个重复；(5)转染后置于37℃，5％co2培养箱中；(6)转染后48h及72h，收取细胞，进行检测。

实施例4总rna提取

参照omegabio-tek公司总rna提取试剂盒操作说明书，提取组织或者细胞rna，具体操作步骤如下：(1)样品处理：a.从组织中提取总rna：取适量-80℃冻存的组织样品，液氮研磨至粉末状后加入装有1ml裂解液的无rna酶离心管中，旋涡振荡，静置孵育2～3min；b.提取培养细胞(贴壁)总rna：去除上清，使用预冷的pbs清洗2遍，直接加入适量裂解液后，室温静置孵育5min，转移至无rna酶离心管中；(2)加入200μl氯仿，旋涡振荡后，置于冰上孵育10min；(3)4℃，12000×g离心15min；(4)吸取分层后的上层水相500μl转移至新的ep管中，加入等体积的70％乙醇，旋涡振荡；(5)将步骤(4)中的样品转移至吸附柱中，10000×g离心1min，弃滤液；(6)加入500μlrnawashbufferⅰ，室温下以10000×g离心1min，弃滤液和收集管；(7)将吸附柱转移至新收集管中，加入500μlrnawashbufferⅱ，室温下以10000×g离心1min，弃滤液；(8)重复步骤(7)，将收集管放空，16000×g离心2min；(9)将吸附柱转移至新的无rna酶离心管中，加入30～45μldepc水，孵育3min，12000×g离心2min，洗脱液即为总rna，置于-80℃冰箱保存。

总rna提取完成后，取1μl待测rna溶液，使用超微量核酸蛋白分析仪检测其吸光值od260/od280为1.8～2.0之间，则可用于后续试验。od260/od280值低于1.8表明样品有蛋白质污染，高于2.0则为有其他核酸污染。

实施例5mirna反转录与qpcr，及mrna反转录与qpcr

mirna反转录按照全式金公司(北京，中国)所生产的反转录试剂盒transscriptgreenmirnafirst-strandcdnasynthesissupermix说明书操作。rt-pcr反应体系：mirnartenzymemix1μl，2×tsmirnareactionmix10μl，rna≤5μg，计算样品添加量并加样，加水(rnase-freewater)至总体积为20μl。反应程序：37℃孵育1h，85℃5s，4℃保存。反转录完成后反应产物置于-20℃保存。

采用qpcr技术，使用transstarttipgreenqpcrsupermix(aq202-01，北京全式金生物技术有限公司)试剂盒，检测mirna表达水平。对于mirna，反应体系：cdna模板1μl，特异性引物0.4μl(0.2μm)，通用引物0.4μl(0.2μm)，top/tipgreenqpcrsupermix10μl，ddh2o8.2μl，总反应体系为20μl。反应程序使用两步法：(1)94℃30s；(2)94℃5s，60℃30s(进行40个循环)。每个样品均检测3次。实验结果采用比较ct值法，即2^-δδct方法计算样品mirna相对表达量水平。

mrna反转录按照全式金公司(北京，中国)transscriptione-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix的说明书操作。rt-pcr反应体系：randomprimer(0.1μg/μl)1μl，2×esreactionmix10μl，rt/rienzymemix1μl，gdnaremover1μl，rna≤5μg，计算rna添加量再加样，加水(rnase-freewater)至总体积为20μl。反应程序：42℃15min，85℃5s，4℃保存。

qpcr检测使用transstarttipgreenqpcrsupermix(aq202-01，北京全式金生物技术有限公司)试剂盒。对于mrna，反应体系为20μl体系：cdna模板1μl，上游引物0.4μl(0.2μm)，下游引物0.4μl(0.2μm)，top/tipgreenqpcrsupermix10μl，ddh2o8.2μl。使用两步法程序：(1)94℃30s；(2)94℃5s，60℃30s(进行45个循环)。每个样品均检测3次。实验结果采用比较ct值法，即2^-δδct方法计算样品mrna相对表达量水平。

本发明采用合成的mir-26amimic/nc和mir-26ainhibitor/nc进行体外细胞水平试验(过表达/对照和抑制/对照试验)，以研究ssc-mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中功能。合成好所需oligo后，在猪卵巢颗粒细胞中进行转染，以检验其过表达和抑制效率。转染浓度为mir-26amimic和mimicnc为100nm，mir-26ainhibitor和inhibitornc为200nm，采用qpcr方法检测其效果，如图4所示，图4为qpcr检测mir-26a小片段转染效率图。

结果表明，转染mir-26amimic组与ncmimic组相比，过表达约42倍，过表达效率较好；转染mir-26ainhibitor组与ncinhibitor相比，抑制效率约为3倍。下述实施例即采用此浓度。

实施例6细胞凋亡

细胞凋亡检测方法如下：猪卵巢颗粒细胞转染48h后，按照上海贝博生物的annexinv-fitc/pi双染细胞凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡，具体步骤：(1)将细胞培养基转移至15ml离心管中，用2mlpbs轻轻润洗细胞，弃去pbs；(2)加入胰酶消化细胞后，用预冷的pbs洗涤细胞2遍，弃去pbs；(3)用400μl1×annexinⅴ结合液悬浮细胞，密度约为1×10⁶细胞/ml；(4)在细胞悬液中加入5μlannexinⅴ-fitc染色液，混匀，2～8℃避光孵育15min；(5)加入10μlpi染色液，混匀，2～8℃避光孵育5min；(6)立即使用流式细胞仪检测凋亡率。

本发明将mir-26amimic/nc和mir-26ainhibitor/nc转染到培养的猪卵巢颗粒细胞中以确定mir-26a是否在调控卵巢颗粒细胞凋亡方面发挥作用。

采用annexinvfitc/pi染色，使用流式细胞仪分析检测卵巢颗粒细胞的凋亡率，其结果如图5所示，图5为mir-26a促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。由图5可知：用mir-26amimic转染的卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于ncmimic组(p<0.01)；用mir-26ainhibitor转染的猪卵巢颗粒细胞凋亡率显著低于ncinhibitor组(p<0.05)。上述结果表明：mir-26a促进细胞凋亡，是猪卵巢颗粒细胞中的一个原凋亡因子。

实施例7类固醇激素分泌水平检测

类固醇激素分泌水平检测如下：培养的猪卵巢颗粒细胞转染48h后，收取细胞培养液上清，2000×g离心20min，取上清，-20℃保存。按照武汉基因美生物科技有限公司生产的elisa检测试剂盒说明书操作，检测雌二醇和孕酮浓度。

由于颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，参与类固醇分泌和卵泡发育；而实施例6表明mir-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，而颗粒细胞的凋亡与雌激素含量密切相关。

本发明采用elisa技术检测转染mir-26amimic/nc和mir-26ainhibitor/nc后猪卵巢颗粒细胞培养液中雌二醇和孕酮的含量，来研究mir-26a对卵巢颗粒细胞雌激素(雌二醇、孕酮)的分泌是否有影响。结果见图6，图6为mir-26a对雌二醇、孕酮分泌的影响图。由图6可知：与nc组相比，转染mir-26amimic能够极显著抑制雌二醇和孕酮的分泌(p<0.01)，转染mir-26ainhibitor极显著促进雌二醇和孕酮的分泌(p<0.01)。

实施例8双荧光素酶基因报告检测

1、获取目的基因序列片段：

根据ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查询的ssc-mir-26a(geneid:100316605)基因序列信息，由上海吉玛制药技术有限公司合成ssc-mir-26amimic和ncmimic。从ncbi查询猪smad4(geneid:397142)和dhcr24(geneid：100628197)基因mrna信息，根据rnahybird(bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测的ssc-mir-26a与靶基因dhcr243’utr、smad43’utr的结合位点，采用全基因合成的方式合成野生型目的基因3’utr区与ssc-mir-26a潜在结合位点的序列(命名为dhcr24-wt，smad4-wt)，突变型目的基因包括与ssc-mir-26a的潜在结合位点的序列(命名为dhcr24-mut，smad4-mut)。目的基因oligo由上海吉玛制药技术有限公司合成。具体如下所示：

使用退火方法得到目的基因序列片段：将合成的smad4-wt、smad4-mut、dhcr24-wt、dhcr24-mutoligo溶解为100μm浓度。按照下表配置退火反应体系：

在pcr仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μm的dsdna模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nm，用于连接反应。

2、目的基因序列片段克隆至载体中

(1)双荧光素酶报告基因质粒使用gp-mirglo质粒，图谱信息如图1所示；(2)用sacⅰ和xhoⅰ对载体gp-mirglo进行酶切，按照表1.5配置酶切反应体系，37℃酶切2h，体系如下：

(3)电泳，用dna凝胶回收试剂盒回收双酶切的gp-mirglo载体条带；

(4)用t4dnaligase连接酶切得到的gp-mirglo载体条带和目的基因dsdna模板，22℃连接2h，连接体系如下：

(5)得到载体：pmirglo-smad4-wt、pmirglo-smad4-mut、pmirglo-dhcr24-wt、pmirglo-dhcr24-mut。

载体构建完成后，对重组质粒进行测序，将测序结果与目的基因序列进行比对，比对无误后，方可进行后续实验，其比对结果如图7-10所示，图7为smad4-wt比对结果图，图8为smad4-mut比对结果图，图9为dhcr24-wt比对结果图，图10为dhcr24-mut比对结果图。由图7-10可知：smad4-wt、smad4-mut、dhcr24-wt以及dhcr24-mut成功连接到双荧光素酶报告基因检测载体中，测序结果与设计的序列比对完全一致，表明载体构建成功，可进行后续实验。

3、转化

(1)取感受态细胞置于冰上4min，待解冻后分装至无菌预冷离心管中，加入10μl连接产物，混匀，冰浴30min；(2)将离心管42℃水浴锅放置90s，立即转移至冰浴冷却3min；(3)在离心管中加入800μllb培养基(不含抗生素)，混匀，置于37℃摇床，250rpm，培育45min以复苏菌体；(4)取200μl培育后的细胞，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的lb平板上；(5)待平板上液体被吸收后，置于37℃培养箱中，培养16h。

4、挑菌培养及测序验证

(1)从培养好的平板上挑选菌落，置于装有5ml(含50μg/ml氨苄青霉素)lb培养基的试管中，37℃，250rpm，培养16h；(2)将菌液用质粒小提取试剂盒(天根生化，dp104-02)抽提质粒，按照说明书操作；(3)取200μl阳性克隆对应的菌液送测序鉴定，剩余菌液甘油保存；(4)将测序结果与目的序列比对无误后，将保存菌液复苏培养并进行大量质粒抽提。

5、细胞转染和双荧光素酶活性检测

(1)转染前将293t细胞消化接种至12孔板，每孔细胞数量约为5×10⁵，置于37℃5％co2培养24h；

(2)溶解稀释合成的microrna，终浓度为20μm；

(3)在1.5mlep管中加入100μlopti-dmem培养基，加入10μlmicrorna，添加1.6μg对应的双荧光报告载体，混匀；在另一ep管中，加入100μlopti-dmem培养基，添加4μllipofectamine2000转染试剂，混匀；室温孵育5min后将两管混合，室温孵育20min；

(4)试验分组：

smad4验证分组为：a.mimicnc+smad4wt；b.mimicnc+smad4mut；c.ssc-mir-26a+smad4wt；d.ssc-mir-26a+smad4mut；

dhcr24验证分组为：a.mimicnc+dhcr24wt；b.mimicnc+dhcr24mut；c.ssc-mir-26a+dhcr24wt；d.ssc-mir-26a+dhcr24mut；

(5)弃去12孔板中的培养基，将转染混合物逐滴加入孔中，混匀，培养箱培育5h；(6)吸弃转染液，加入500μl含10％fbs的dmem培养液，37℃5％co2培养48h；(7)收集细胞，使用dual-luciferase报告基因检测系统试剂盒进行荧光检测。

在猪卵巢颗粒细胞共转染mir-26amimc/mimicnc和pmirglo-smad4-wt/pmirglo-smad4-mut、pmirglo-dhcr24-wt/pmirglo-dhcr24-mut，48h后，检验相对荧光强度，以确定mir-26a是否靶向结合到dhcr24和smad43’utr区。

结果如图11所示，图11为实施例6的双荧光素酶活性检测图。由图11a可知：共转染mir-26amimic和pmirglo-dhcr24-wt重组质粒后，与共转染mimicnc组相比，转染mir-26amimic能够显著抑制荧光素酶报告基因的活性(p<0.05)；共转染pmirglo-dhcr24-mut重组质粒，转染mir-26amimic组与对照组mimicnc相比，对报告基因荧光活性无显著影响(p>0.05)，即当dhcr243’utr区域与mir-26a结合区域发生突变后，mir-26a不能结合到dhcr243’utr上，从而影响荧光素酶报告基因活性。而图11b可知：对于靶基因smad4，其结果也如dhcr24一样。

双荧光素酶报告实验结果表明，mir-26a能够通过靶向结合dhcr24和smad4的3’utr区域从而抑制报告基因荧光活性。

实施例9qpcr检测mir-26a对dhcr24、smad4转录水平的影响

本发明采用mir-26amimic/nc和mir-26ainhibitor/nc转染培养猪卵巢颗粒细胞后检测其mrna表达水平以进一步验证mir-26a与dhcr24和smad4之间的靶向关系，其结果如图12所示，图12为qpcr验证mir-26a转录水平调控靶基因表达图。

如图12a所示，在猪卵巢颗粒细胞中转染mir-26amimic后，与转染mimicnc组相比，极显著下调dhcr24mrna的表达(p<0.01)；转染mir-26ainhibitor与inhibitornc相比，显著上调dhcr24mrna表达(p<0.05)。由图12b可知，对于靶基因smad4，mir-26amimic显著下调smad4mrna表达(p<0.05)，mir-26ainhibitor极显著上调smad4mrna的表达(p<0.01)。

qpcr检测结果表明：mir-26a在转录水平抑制dhcr24和smad4表达。上述结果表明：mir-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，dhcr24和smad4是mir-26a的靶基因。

实施例10westernblot检测

westernblot检测方法如下：(1)细胞收集及蛋白提取：细胞消化后，收集细胞，2500rpm10min，加入1mlripa细胞裂解液(含1mmpmsf)，置于冰上裂解30min，收集上清液，即为细胞总蛋白；(2)sds-page电泳：在细胞总蛋白样品中，按照1：4加入5×sds-page缓冲液，沸水浴加热10min，充分变性蛋白；样品冷却后，将样品上样至sds-page胶加样孔，电泳至溴酚蓝刚出胶底部为止；(3)转膜：将pvdf膜剪裁至与胶条相同大小，甲醇浸泡3～5min，用转膜缓冲液浸润5min；转膜装置从下往上依次放置阴极板、3层滤纸、凝胶、pvdf膜、3层滤纸、阳极板，每一步均需去除气泡；300ma恒流转膜60min；(4)封闭：转膜结束，将pvdf膜在western洗涤液中漂洗5min，加入封闭液(5％脱脂奶粉)，摇床室温封闭2h；(5)一抗孵育：参照说明书，加入dhcr24和smad4一抗稀释液(dhcr24一抗：1：500，smad4：1：1000)，4℃孵育过夜，pbst洗涤10min，洗涤3次；(6)二抗孵育：根据说明书，按1：2000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗室温孵育2h，pbst洗涤10min，3次；(7)蛋白检测：参照说明书，使用ecl超敏发光试剂盒来检测蛋白；使用imagej软件进行胶片条带分析。

本发明通过westernblot技术从翻译水平进一步验证mir-26a对dhcr24和smad4蛋白水平的影响。在猪卵巢颗粒细胞中转染mir-26amimic/mimicnc或mir-26ainhibitor/inhibitornc，72h后检测dhcr24和smad4蛋白表达量，结果如图13所示，图13为westernblot验证mir-26a对靶基因蛋白水平的影响图。如图13a所示，在猪卵巢颗粒细胞中转染mir-26amimic组与mimicnc组相比，dhcr24蛋白表达量极显著下调(p<0.01)；转染mir-26ainhibitor组与转染inhibitornc组相比，dhcr24蛋白表达量极显著上调(p<0.01)。如图13b所示，与dhcr24结果一致，转染mir-26amimic能够极显著抑制smad4蛋白表达(p<0.01)，转染mir-26ainhibitor极显著促进smad4蛋白表达(p<0.01)。westernblot结果表明：mir-26a在翻译水平负调控dhcr24和smad4的表达。

实施例11si-dhcr24、si-smad4干扰效率检测

实施例6结果表明：mir-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，dhcr24和smad4是mir-26a的靶基因。

本发明合成了dhcr24、smad4小干扰rna片段，用于在细胞水平验证其功能，以研究mir-26a是否是通过调控其靶基因dhcr24和smad4的表达发挥作用。

对于靶基因dhcr24，设计合成了3个小干扰rna片段(分别命名为si-dhcr24-1、si-dhcr24-2、si-dhcr24-3)以及对照(nc-sirna)，在培养的猪卵巢颗粒细胞中转染小片段，检验其干扰效率，筛选出最佳的一条小干扰rna用于后续试验。

qpcr检测结果如图14所示，图14为qpcr检测si-dhcr24、si-smad4干扰效率图。由图14a可知：转染si-dhcr24-1/2/3后，与对照组sirna-nc相比，均能够显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)下调dhcr24表达，其中si-dhcr24-2组干扰效率最高，故选取此条小干扰rna用于后续试验，在此命名为si-dhcr24。对于靶基因smad4，在猪这一物种中已有相关研究报道(liq,dux,panz,etal.thetranscriptionfactorsmad4andmir-10bcontributetoe2releaseandcellapoptosisinovariangranulosacellsbytargetingcyp19a1[j].molcellendocrinol,2018,476:84-95.)，故使用已有序列进行合成，命名为si-smad4。由图14b可知：在猪卵巢颗粒细胞中转染si-smad4后，与对照组sirna-nc相比，能够极显著下调smad4表达(p<0.01)，故使用此条序列进行后续试验。

实施例12干扰dhcr24、干扰smad4促进猪卵巢颗粒细胞凋亡

本发明采用转染rna小干扰片段si-dhcr24、si-smad4来研究靶基因dhcr24和smad4在猪卵巢颗粒细胞中对细胞凋亡的影响，使用上述流式细胞术检测颗粒细胞凋亡，其结果如图15-16所示，图15为干扰dhcr24对颗粒细胞凋亡的影响图，图16为干扰smad4对颗粒细胞凋亡的影响图。

图15a表明：转染si-dhcr24组细胞凋亡率极显著高于sirna-nc组(p<0.01)，并且图15c也表明转染si-dhcr24组显著上调促凋亡基因caspase-3的表达(p<0.05)，但通过图15b可知转染si-dhcr24组对bcl-2基因的表达无显著影响(p>0.05)。

通过图16a的结果表明：转染si-smad4组猪卵巢颗粒细胞凋亡率极显著高于对照组sirna-nc组(p<0.01)，并且图16b也表明转染si-smad4组显著抑制抗凋亡基因bcl-2的表达(p<0.05)，图16c表明转染si-smad4组显著促进促凋亡基因caspase-3的表达(p<0.05)。

综合上述结果，干扰dhcr24和smad4的表达能够促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡。

实施例13干扰dhcr24、干扰smad4对雌激素分泌的影响

本发明采用酶联免疫吸附实验(elisa)检测干扰dhcr24和smad4后细胞培养液中雌二醇、孕酮的浓度，以观测dhcr24和smad4在猪卵巢颗粒细胞中对雌激素、孕酮分泌的影响。

结果如图17所示，图17为干扰靶基因对雌二醇、孕酮的影响图。由图17a可知，与转染sirna-nc组相比，转染si-dhcr24极显著降低雌二醇的分泌(p<0.01)，但转染si-smad4组极显著提高了雌二醇水平(p<0.01)。

图17b可知，对孕酮的影响，转染si-dhcr24组与对照组sirna-nc组相比，孕酮浓度显著降低(p<0.05)，转染si-smad4组孕酮浓度极显著升高(p<0.01)。

以上结果表明，在猪卵巢颗粒细胞中抑制dhcr24表达可抑制雌二醇和孕酮的分泌，抑制smad4表达促进颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮。

本发明首先通过分析mir-26a在不同物种中的保守性，确定mir-26a在不同物种间成熟序列高度保守，且种子序列完全保守，故推测其在猪卵巢颗粒细胞中可能也存在相似功能。因此为研究mir-26a在猪卵巢颗粒细胞中的功能，本发明通过合成mir-26amimic/nc、mir-26inhibitor/nc，转染到猪卵巢颗粒细胞中，以研究其对卵巢颗粒细胞功能的影响。

本发明在培养的猪卵巢颗粒细胞过程中，过表达mir-26a能够促进卵巢颗粒细胞凋亡，抑制雌二醇和孕酮激素分泌；而抑制内源性mir-26a表达抑制颗粒细胞凋亡，促进雌二醇和孕酮激素分泌。根据已有研究表明，mirna在调控颗粒细胞凋亡及雌激素分泌之间存在关联。这些研究结果与本发明结果一致，即mirna可通过调控雌激素(雌二醇、孕酮)的合成，进而调控卵巢颗粒细胞凋亡。

本发明结果表明：mir-26a可调控卵巢颗粒细胞凋亡和类固醇合成。据本申请人所知，本发明首次表明/揭露mir-26a可调节猪卵巢颗粒细胞中的细胞凋亡和类固醇合成。

根据本申请人前期对高低产母猪卵巢mrna及mirna转录组分析，筛选出dhcr24和smad4可能是mir-26a的靶基因。随后通过生物信息学分析，确定dhcr24和smad4mrna3’utr区域存在mir-26a的结合位点。

但生物信息学方式预测只能提供参考，具体的验证还需生物实验技术方法。生物技术方法主要分为两类：一类以mirna与靶基因mrna直接作用为基础的方法，另一类为间接检测mirna与靶基因mrna的相互作用。这两种检测技术，第一类包括双荧光素酶报告基因或rna与蛋白质免疫共沉淀技术等，其准确性较高；第二类准确性较低，主要是通过改变mirna表达，检测靶基因mrna及蛋白水平的变化，从而推测其相关关系。

本发明首先通过生物信息学方法确定dhcr24和smad4是mir-26a的潜在靶基因，随后通过两种生物技术方法进行验证。双荧光素酶报告基因检测系统具有灵敏度高、准确性高等特性。为了验证mir-26a与潜在靶基因dhcr24、smad4是否存在靶向结合调控关系，首先构建靶基因野生型wt质粒、突变型mut质粒，随后将构建的重组质粒与mir-26a模拟物共转染至293t细胞，使用双荧光活性检测来进行验证靶基因3’utr与mirna靶向关系。本发明揭露转染mir-26a模拟物显著降低dhcr24和smad4基因野生型载体荧光素酶活性，对突变型载体无显著影响；表明mir-26a通过靶向结合dhcr24和smad4的3’utr区域抑制报告基因荧光活性。双荧光素酶报告基因检测结果表明，mir-26a与dhcr24、smad4存在靶向关系。

为了进一步验证它们之间的靶向关系，本发明使用qpcr技术和westernblot技术进行验证。qpcr检验表明：在猪卵巢颗粒细胞中过表达mir-26a能够在转录水平抑制dhcr24和smad4基因表达，抑制mir-26a表达在转录水平促进dhcr24和smad4表达。使用westernblot检测发现，与qpcr结果一致，mir-26a在翻译水平调控dhcr24和smad4蛋白表达。

本发明采用所合成的dhcr24小干扰rna片段对颗粒细胞功能的影响，确定抑制猪卵巢颗粒细胞中dhcr24的表达可以显著增加caspase-3的表达，促进细胞凋亡，抑制雌二醇和孕酮的分泌，提示dhcr24在猪卵巢颗粒细胞中具有抗凋亡功能。而已有研究表明在神经细胞和其他细胞模型所示中，dhcr24蛋白的抗凋亡作用与抑制caspase-3的激活有关。同时本发明确定，抑制dhcr24能够促进caspase-3表达，这与上述研究结果一致。并且本申请人还发现：可能由于dhcr24启动子区域存在雌激素反应因子，抑制dhcr24基因的表达也可以抑制猪颗粒细胞中雌激素和黄体酮的分泌，

由于卵巢体细胞(主要是颗粒细胞)和卵母细胞相互作用决定着卵泡的发生，排卵及黄体化。在卵泡发育的过程中，smad蛋白广泛表达与卵巢发育的各个阶段，其表达水平随着卵巢功能的发育有周期性的变化。

已有研究发现用si-smad4处理猪卵巢颗粒细胞后改变了许多的基因表达，这些基因参与了卵泡颗粒细胞的关键过程；smad4的缺失时可以使卵巢颗粒细胞提前黄体化；在卵巢中特异性敲除smad4基因会导致小鼠颗粒细胞过早黄体化，导致卵巢早衰，生育能力下降等；进一步研究发现沉默smad4基因能够促进卵巢颗粒细胞凋亡。

本发明在猪卵巢颗粒细胞中抑制smad4的表达，抑制抗凋亡基因bcl-2表达，上调促凋亡基因caspase-3表达，促进颗粒细胞的凋亡，这与上述研究结果一致。在猪卵巢颗粒细胞中抑制smad4表达后，极显著促进雌二醇和孕酮。

同时现有研究发现，在猪卵巢颗粒细胞中过表达smad4能够上调cyp19a1表达，促进雌二醇分泌；在小鼠卵巢中特异性敲除smad4基因，会破坏类固醇激素调节，促进孕酮分泌。这也与本发明结果一致。

综上所述，本发明表明：dhcr24和smad4是mir-26a的靶基因，mir-26a通过靶向调控dhcr24和smad4表达促进猪卵巢颗粒细胞凋亡；mir-26a能够抑制猪卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌，抑制dhcr24表达能够降低雌二醇和孕酮分泌，但抑制smad4表达却升高雌二醇和孕酮分泌，说明mir-26a抑制猪卵巢颗粒细胞激素分泌主要是通过调控dhcr24表达从而调节类固醇合成通路影响激素分泌。

上述m为mol/l，即mm为mmol/l，μm为μmol/l，nm为nmol/l。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。