一种基于HRM技术的马尾松SNP基因分型方法与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种基于hrm技术的马尾松snp基因分型方法。
背景技术：
：马尾松是我国重要的优质用材树种之一，其经济价值高、用途广，在森林资源发展、松香林产业化及森林生态服务功能中占据重要地位。随着科学技术手段的发展和科学研究的由浅入深，对与马尾松的研究已经从传统的形态学领域和应用领域深入到了分子生物领域。snp(singlenucleotidepolymorphism)是生物体中最丰富的遗传变异形式，目前根据自动化程度的高低，大致将snp的检测方法分为两大类，即基于凝胶电泳的snp检测方法和高通量、自动化的snp检测方法。基于凝胶电泳的snp检测方法包括变性梯度凝胶电泳(ddge)、单链构象多态性(sscp)、酶切扩增多态性序列(caps)、等位基因特异性pcr(as-pcr)。这些传统方法技术简便，成本很低，但是所需的时间长、灵敏度有限、稳定性差，难以开展大规模的工作。而且，以凝胶电泳为基础的传统方法，dna链二级结构的判断容易造成假阳性或假阴性。自动化、高通量检测snp的技术包括直接测序、dna芯片、变性高效液相色谱(dhplc)、质谱检测技术、高分辨率熔解曲线(hrm)等。与基于凝胶电泳的snp检测方法相比，此类方法可实现snp高通量、自动化检测，准确性有很大提高，但也存在成本较高的问题。高分辨熔解曲线(high-resolutionmelt，hrm)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的pcr技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在pcr结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-snp、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，hrm技术受到普遍关注。目前，snp检测已应用于松、杨、黄杉、桉和云杉等属的多个树种的遗传育种学研究。为其分子标记辅助选择、改良木材材质、缩短育种周期及揭示林木群体进化规律及其生态学意义奠定了基础。而目前关于马尾松的快速、准确的snp基因分型的研究，鲜见报道。技术实现要素：发明目的：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于hrm技术的马尾松snp基因分型方法，操作简便，无需序列特异性探针以及后续测序，只需要设计pcr引物，进行pcr反应，接着直接进行hrm，便可完成对样品的基因型分析，特异性好，完全闭管操作。本发明的另一目的是提供上述方法在构建马尾松样本的snp指纹图谱中的应用。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种基于hrm技术的马尾松snp基因分型方法，包括以下步骤：1)马尾松snp位点筛选；2)根据筛选的snp位点，设计对应引物，各引物的核苷酸序列分别为：snp-1上游引物：5′-acggcatccctgtaatacct-3′；snp-1下游引物：5′-gtgtggaaggatagggtaag-3′；snp-2上游引物：5′-cagagctggcgatgatgtc-3′；snp-2下游引物：5′-gaatcgctcacactctcaga-3′；snp-3上游引物：5′-gagagtagagcaagtagacat-3′；snp-3下游引物：5′-aacacccattcgtctcagag-3′；snp-4上游引物：5′-cgaaacagtggcattacagg-3′；snp-4下游引物：5′-aaagggtggtctctgtcgg-3′；snp-5上游引物：5′-gacatcaagccatttcctcaa-3′；snp-5下游引物：5′-gtgatacaaaaggaactggga-3′；snp-6上游引物：5′-cagcacagcccgaacactt-3′；snp-6下游引物：5′-gagatgtcataggagaagtag-3′；snp-7上游引物：5′-aagagccagcatccacgga-3′；snp-7下游引物：5′-gcggttcattatctgttgcc-3′；snp-8上游引物：5′-tcgtatgcggtgctttctga-3′；snp-8下游引物：5′-gagttgttagaagccttggg-3′；snp-9上游引物：5′-tcgcacatcagagtcacttg-3′；snp-9下游引物：5′-tggtttcaaagcactggatac-3′；snp-10上游引物：5′-caggttgggatgataagagat-3′；snp-10下游引物：5′-gggttcagttcagtgtatcta-3′；3)马尾松基因组dna提取；4)马尾松基因组dna进行pcr反应和hrm分析；5)snp基因分型验证。步骤1)中马尾松snp位点的筛选为：根据马尾松分化木质部及其原生质体的转录组测序结果进行snp位点预测，对所获得的snp预测位点进行筛选，预测的snp位点在马尾松分化木质部及其原生质体的样本中表现出不同的碱基突变类型，且突变位点前后100bp范围内不存在其他snp预测位点。基于hrm技术的马尾松snp基因分型方法在构建马尾松样本的snp指纹图谱中的应用：获得27份马尾松dna样本对应的指纹图谱，分别为：dna样本1指纹代码：154455；dna样本2指纹代码：534154；dna样本3指纹代码：534555；dna样本4指纹代码：135434；dna样本5指纹代码：134554；dna样本6指纹代码：134134；dna样本7指纹代码：135154；dna样本8指纹代码：154154；dna样本9指纹代码：124544；dna样本10指纹代码：125134；dna样本11指纹代码：424142；dna样本12指纹代码：425554；dna样本13指纹代码：125554；dna样本14指纹代码：425134；dna样本15指纹代码：124554；dna样本16指纹代码：124154；dna样本17指纹代码：125154；dna样本18指纹代码：424554；dna样本19指纹代码：124134；dna样本20指纹代码：425144；dna样本21指纹代码：124542；dna样本22指纹代码：125132；dna样本23指纹代码：154142；dna样本24指纹代码：124132；dna样本25指纹代码：134152；dna样本26指纹代码：424532；dna样本27指纹代码：124135。步骤1)中筛选到的snp位点如下：snp-1：等位基因突变位点为：a/g；snp-2：等位基因突变位点为：c/a；snp-3：等位基因突变位点为：g/t；snp-4：等位基因突变位点为：c/t；snp-5：等位基因突变位点为：a/c；snp-6：等位基因突变位点为：c/t；snp-7：等位基因突变位点为：c/t；snp-8：等位基因突变位点为：g/a；snp-9：等位基因突变位点为：g/c；snp-10：等位基因突变位点为：g/a。步骤4)中pcr反应体系为：forget-me-nottmmix5μl，0.25μm上下游引物各1μl，30ngdna1μl，ddh2o2μl，总体积10μl。步骤4)中pcr反应程序为：60℃2min，95℃2min，40个循环程序，60℃1min，95℃15s，60℃15s；循环程序为：95℃1s，60℃30s。步骤5)中snp基因分型验证为：对snp标记的pcr产物进行sanger测序，验证snp基因分型的准确性。指纹图谱中的snp包含snp-2、snp-3、snp-4、snp-5、snp-6和snp-9。有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：1)结果高度准确、可靠：通过sanger测序验证snp基因分型，符合分型结果。2)操作快速简便：无需序列特异性探针以及后续测序，pcr产物无需后续处理，完全闭管操作。进行不同个体间的样本检测，一般整个试验过程只需几小时即可完成，与传统的测序技术相比，省时省力。3)无需基于凝胶电泳进行，减少试剂和耗材的使用，更加环保，同时节省人力和减少人工误差。4)检测结果灵敏度高：对待测样本仅需提供模板dna30ng即可准确进行鉴定。5)效率高：相比于ssr指纹图谱，虽然snp单位点的理论信息量不如ssr丰富，但是snp在全基因组范围内密度远高于ssr，基于hrm技术的马尾松snp基因分型方法可以迅速获取指纹信息，综合效率高于ssr指纹。附图说明图1是部分样本dna琼脂糖凝胶电泳结果图；图2是不同引物浓度下的熔解峰图；图中，a、b、c体系引物浓度分别为0.15μm、0.25μm、0.35μm；图3是不同底物浓度的熔解峰图；图中，a、b、c体系底物浓度分别为10ng/μl、30ng/μl、50ng/μl；图4是snp-3、snp-4和snp-8的hrm分型图；图中，a为snp-3对应引物扩增，b为snp-4对应引物扩增，c为snp-8对应引物扩增；图5是snp-6位点pcr扩增产物的sanger测序结果图；图中，a为6号马尾松样本，b为扩增8号马尾松样本。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。实施例1马尾松hrm-snp标记方法1.马尾松snp位点筛选以马尾松分化木质部及其原生质体的转录组测序结果为数据基础，通过samtools和picard-tools等工具对序列进行比对，最后通过变异检测软件gatk3(vanderauweraga，carneiromo，hartlc，etal.fromfastqdatatohigh-confidencevariantcalls：thegenomeanalysistoolkitbestpracticespipeline[j].currentprotocolsinbioinformatics，2013，43(1)：11.10.1-11.10.33.)进行snpcalling位点的挖掘，并对原始结果进行过滤(过滤掉质量值小于40，距离小于2的snp)，根据其所获得的预测位点及其突变信息对snp位点筛选，筛选标准如下：预测的snp位点在马尾松分化木质部及其原生质体组织样本中表现出不同的碱基突变类型，且突变位点前后100bp范围内不存在其他snp预测位点，在初筛的结果中随机选择35个snp预测位点进行后续的验证。通过snp位点的预测与筛选，最终从35个snp预测位点中选择出10个snp位点，各位点信息如表1所示：表110个snp位点信息2.对应引物的设计与合成采用oligo6.0primeranalysis软件(bymolecularbiologyinsights)根据snp预测位点位置及信息进行引物设计，其设计原则如下：引物长度一般在18～28碱基之间；碱基分布随机，g+c含量在40％～60％之间。引物错配数少于4个碱基，无发卡结构。tm值在58-60℃之间，产物长度在150bp-250bp之间，前后引物距离snp预测位点至少50bp。引物应具有特异性，产物不能形成二级结构。引物交由南京金斯瑞生物科技公司合成，引物浓度为10μmol/μl，放置于-20℃冰箱保存备用。10个snp位点对应引物的核苷酸序列如表2所示。表210个snp位点对应引物序列3.马尾松基因组dna提取取27个来自不同种源地如江西、浙江、湖南和贵州马尾松针叶样本，其个体编号及种源信息如表3所示。针叶样本放于-40℃超低温冰箱保存备用。表3马尾松样本编号及种源信息编号区号家系号种源编号区号家系号种源15523浙江155515浙江25524浙江165516浙江35517浙江175520浙江45518浙江185522浙江5119湖南汝城195525浙江655湖南资兴2056湖南绥宁753湖南江永2158湖南江永82548江西武功山225521浙江92549江西武功山235519浙江102574江西崇义242550江西武功山11515江西吉安252564江西安远122561江西安远262575江西崇义132547江西武功山27114湖南汝城142562江西安远使用植物基因组dna提取试剂盒(庄盟生物，北京)提取马尾松基因组dna，操作方法如下：1)取100mg的新鲜马尾松针叶，剪成1厘米左右的小段植物组织加入液氮充分研磨成粉末，并迅速转移至预先装有600μl植物缓冲液a的的离心管中，立即加入5μl的rnasea(10mg/ml)，振荡混匀15秒。2)将离心管于65℃水浴加热10分钟，并不时颠倒混匀。3)在水浴后加入70μl的植物缓冲液b。涡旋混匀1分钟，在12000rpm离心10分钟。4)吸取上层水相清液转移至一个干净的新离心管中。加入上清液0.5倍体积事先预冷的异丙醇，缓慢颠倒3-5次充分混匀。5)用移液枪将混匀后的液体全部转移到吸附柱中，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。6)将吸附柱放回收集管中，加入500μl植物缓冲液c，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。7)向吸附柱中加入700μl事先加入无水乙醇的漂洗液w2，静置2分钟，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。8)向吸附柱中加入500μl事先加入无水乙醇的漂洗液w2，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。9)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，取出吸附柱，放入一个新的离心管中，室温放置数分钟以晾干漂洗液。10)向吸附柱的吸附膜中央滴加70μl65℃水浴加热的去离子水，室温静置3min。12000rpm离心2分钟，得到dna溶液。重复洗脱一次以提高dna质量。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna质量，使用nanodrop2000微型分光光度仪测定dna浓度纯度。在提取dna模板的第3步初次离心后，在含有dna的清液之上还有一层粘稠油状物，这可能是由于马尾松针叶中富含脂类，吸取水相清液时需小心避开油层以免影响dna模板的质量。在第9步晾干漂洗液步骤中，仅静置离心柱2min并不能完全晾干漂洗液w2与无水乙醇，导致使用nanodrop微型分光光度仪检测dna浓度与盐离子浓度时发现od260/od230值较低，即提取的dna样本盐离子浓度过高，质量不稳定。改进方案后，发现37℃烘干离心柱20min的方法可以有效晾干含有无水乙醇的漂洗液以及其中所含杂质，获得质量更好的dna模板。为保证hrm分型结果的准确性，将提取的dna溶液浓度统一稀释到30ng/μl，并于4℃保存备用。dna母液放置于-20℃冰箱保存。4.基于hrm技术的snp基因分型：马尾松基因组dna进行pcr反应和hrm分析，收集数据，对每个样品进行snp位点基因型分析。1)hrm分型体系优化依据表4pcr反应体系配置反应液：表4forget-me-nottm染料标准反应体系成分用量μlforget-me-nottmmix5.0primerf1.0primerr1.0dna1.0ddh2o2.0总计10.0pcr反应程序如下：60℃2min，95℃2min，40个循环程序，60℃1min，95℃15s，60℃15s；循环程序为：95℃1s，60℃30s。将实时定量96孔pcr板放入appliedbio-systemviia7实时定量pcr仪中进行pcr扩增。以snp-9为例，分别设置不同的dna模板浓度和引物浓度。dna模板浓度梯度为：10ng/μl、30ng/μl、50ng/μl；引物浓度梯度为：0.15μm、0.25μm、0.35μm。随机选择三个不同种源的马尾松个体获得其基因组dna，使用forget-me-nottm染料进行pcr扩增，并基于熔解曲线进行分析。图2a-c分别为三种引物浓度下的分型结果。结果表明，当体系引物浓度为0.25μm时(图2b)，pcr产物熔解曲线较为一致，引物浓度降低至0.15μm时(图2a)熔解曲线差异性较大。引物浓度提升到0.35μm时(图2c)的熔解曲线与0.25μm时无明显差别。推测该现象可能是引物浓度过低导致pcr反应过程不稳定。图3a-c分别为三种dna模板浓度下的分型结果。比较图3的结果可发现，dna模板浓度在10ng/μl时(图3a)个别样本出现杂峰，可能是模板浓度过低导致了点样误差。在dna模板浓度为30ng/μl(图3b)和50ng/μl(图3c)所产生的熔解峰均为单峰，且荧光强度峰值出现在700,000上下，差异较小。考虑到成本与效率，选用引物浓度0.25μmol、dna模板30ng/μl建立马尾松的hrm基因分型体系。2)hrm分型体系在马尾松snp预测位点分型中的应用以27个马尾松样本的基因组dna为模板，使用上一步中优化过的pcr反应体系，对10个snp预测位点进行高温熔解曲线的snp分型。根据snp位点上不同碱基突变造成的熔解曲线形状和位置的差异，将分型结果与转录组预测的基因型对比，推测出每个snp位点各分型的基因型。理论上，每个snp位点可以将样本分为三类，其中纯和个体两类，杂合个体一类。少数样本会出现突变基因型，可能是稀有突变位点或者是实验样本量不足导致计算偏差，分型曲线去除此类个体。图4-a为利用snp-3对应引物扩增的hrm分型结果，样本被成功区分为三个类型，对照转录组预测可推测其基因型分别为a/a、a/g以及g/g。同样，snp-4位点片段扩增之后，也可以通过hrm将27份样本分成c/c和c/t两种基因型(图4b)，snp-8可将样本区分为g/g、a/g以及a/a三种基因型(图4c)。基于hrm技术的snp分型，推测出27份马尾松样本的10个阳性snp位点基因型，如表5所示。表527份马尾松样本分型结果结果显示：snp-1位点27个样品a/g基因型出现7次，g/g基因型出现15次，a/a基因型出现5次。snp-2位点27个样品a/c基因型出现2次，a/a基因型出现19次，c/c基因型出现6次。snp-3位点g/t基因型出现3次，g/g基因型出现17次，t/t基因型出现7次。snp-4位点c/t基因型出现9次，c/c基因型出现18次，t/t基因型出现0次。snp-5位点a/c基因型出现9次，a/a基因型出现16次，c/c基因型出现2次。snp-6位点c/t基因型出现2次，t/t基因型出现8次，c/c基因型出现5次。snp-7位点c/t基因型出现13次，t/t基因型出现9次，c/c基因型出现17次。snp-8位点a/g基因型出现2次，a/a基因型出现21次，g/g基因型出现4次。snp-9位点g/c基因型出现3次，g/g基因型出现7次，c/c基因型出现17次。snp-10位点a/g基因型出现2次，g/g基因型出现25次。5.snp基因分型验证选取各分型典型样本送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行sanger测序，根据测序峰图和等位基因出现的频率确定基因型，并与基于hrm技术的snp基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。如图5-a、b，以snp-6位点为例，通过sanger测序获得基因峰图，参照表1，其扩增片段的snp位点为c/t突变，图5-a为6号模板基因扩增产物，基因型为t/t，图5-b为8号模板基因扩增产物，基因型为c/t。均符合分型结果，认为分型准确性较高。实施例2基于hrm技术的马尾松snp基因分型方法在构建马尾松样本的snp指纹图谱中的应用基于基因分型结果，绘制出27个马尾松样本的指纹图谱。如表6所示，同一引物的分型结果以不同数字加以区分，表明各个马尾松样品在基因分型时被分到不同了的组别。由于只需其中6个位点(snp-2、snp-3、snp-4、snp-5、snp-6和snp-9)即可将27个马尾松完全区分并构建dna指纹图谱，指纹不包含snp-1、snp-7、snp-8和snp-10。表66个snp位点对27份马尾松样本绘制的指纹图谱dna样本指纹代码dna样本指纹代码dna样本指纹代码115445510125134191241342534154114241422042514435345551242555421124542413543413125554221251325134554144251342315414261341341512455424124132713515416124154251341528154154171251542642453291245441842455427124135注：纯合型aa，gg，tt，cc对应1，2，3，4，突变型对应5。当前第1页12