一种TTK酶活性的快速检测方法及其应用与流程

本发明属于生物化学
技术领域：
，具体涉及一种ttk酶活性的快速检测方法及其应用。
背景技术：
：ttk是一种磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸的蛋白激酶，是一种纺锤体检测点复合物，其主要生物学功能是参与中心体的复制及纺锤体检测点。在有丝分裂过程中，这种蛋白质是在中心粒上的染色体排列中心重叠所必需的。它被发现是一个有丝分裂检查点蛋白，用于精确分离有丝分裂时的染色体。当这种蛋白质不能降解并产生过量的中心体时，便会产生异常的有丝分裂纺锤体，从而引发癌症产生。研究发现双特异性蛋白激酶ttk是usp9x的潜在底物。进一步的实验证据证实，usp9x通过直接相互作用与k48泛素链来稳定ttk蛋白。通过对非小细胞肺癌临床样本的免疫组织化学分析表明，在肿瘤组织中，usp9x和ttk的蛋白表达水平显著升高，呈正相关关系。因此ttk有望成为一个新的癌症治疗靶点。针对此靶点，以往的研究文献中通常采用elisa方法建立实验评价模型，并进行抑制剂活性的评价。elisa方法在操作时，有很多洗板步骤，不适合放在384孔板中进行；且实验操作步骤较长，不适合在一天之内进行大量的平行测试板操作。技术实现要素：针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种ttk酶活性的快速检测方法及其应用，该方法利用此蛋白在分子水平可以将底物磷酸化的原理，基于adp-glotm激酶实验，直接测定反应中消耗的atp的量来定量反应进程。整个反应在384孔板中进行，不涉及吸出和洗板过程，因此降低了检测过程中可能出现的操作误差，同时增加了通量，适用于结合高通量移液工作站设备进行大量的微孔板操作。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的第一个目的是提供一种ttk酶活性的快速检测方法，包括以下步骤：(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品分别与ttk酶试剂、mbp蛋白/atp混合液共孵育进行激酶反应产生adp；(2)向步骤(1)的三组激酶反应体系中分别添加adp-glotm反应试剂共孵育，终止激酶反应并消耗完剩余atp；(3)向步骤(2)的三组反应体系中分别添加激酶检测试剂共孵育，使adp转化成atp，并读取新合成的atp的发光值rlu；(4)按酶活＝(rlu(sample)-rlu(blank))/(rlu(pos.ctrl)-rlu(blank))×100％计算ttk酶的活性；其中rlu(pos.ctrl)为空白对照品与ttk酶激酶反应的激酶读值，rlu(blank)为待测样品中未添加ttk酶时激酶读值。进一步地，所述步骤(1)的待测样品为待测化合物溶解于缓冲液所形成的溶液，阳性对照品为通用激酶抑制剂星孢菌素溶解于缓冲液所形成的溶液，空白对照为缓冲液，所述缓冲液包括40mmtris、20mmmgcl2、0.1mg/mlbsa和50μmdtt，缓冲液ph7.5。进一步地，所述步骤(1)中ttk酶试剂浓度为1.0-5.0ng/μl，待测样品浓度为50μm-0.64nm，阳性对照品浓度为50μm-0.64nm，mbp蛋白/atp混合液中mbp蛋白浓度为0.25mg/ml，atp浓度为125μm。进一步地，所述步骤(1)的共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为60-120min。进一步地，所述步骤(2)的adp-glotm反应试剂与步骤(1)的激酶反应体系等体积。进一步地，所述步骤(2)的共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为30-60min。本发明的第二个目的是提供如上述任一项所述的ttk酶活性的快速检测方法在ttk靶点抑制剂的筛选中的应用。本发明的第三个目的是提供如上述任一项所述的ttk酶活性的快速检测方法在ttk靶点相关药物的筛选中的应用。本发明的第四个目的是提供一种ttk靶点抑制剂的筛选试剂盒，包括：缓冲液、空白对照品、阳性对照品、ttk酶试剂、mbp蛋白/atp混合液、adp-glotm反应试剂和激酶检测试剂，所述缓冲液包括40mmtris、20mmmgcl2、0.1mg/mlbsa和50μmdtt，缓冲液ph＝7.5；所述空白对照品为缓冲液；所述阳性对照品为通用激酶抑制剂星孢菌素溶解于缓冲液所形成的溶液，其浓度为50μm-0.64nm；所述ttk酶试剂为ttk酶溶解于缓冲液所形成的溶液，浓度为1.0-5.0ng/μl；所述mbp蛋白/atp混合液为atp和mbp蛋白溶解于缓冲液所形成的溶液，atp浓度为125μm，mbp蛋白浓度为0.25mg/ml。应用上述ttk靶点抑制剂的筛选试剂盒筛选ttk靶点抑制剂的方法，包括：(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品各1μl，加入到微孔板的三个不同的孔中，微孔板离心，使待测化合物和阳性对照聚集到微孔板底部；(2)向步骤(1)的三个微孔中各加入2μlttk酶试剂，加完后微孔板离心；(3)向步骤(2)的三个微孔中各加入2μlmbp蛋白/atp混合液，加完后微孔板离心；(4)离心完毕后，给微孔板贴膜，压紧贴膜，25-30℃条件下共孵育60-120min；(5)步骤(4)结束孵育后，取adp-glotm反应试剂5μl/孔分别加入到三个微孔中，微孔板离心，25-30℃条件下孵育30-60min；(6)步骤(5)结束孵育后，取激酶检测试剂10μl/孔分别加入到三个微孔中，微孔板离心，25-30℃条件下孵育20-60分钟；(7)步骤(6)结束孵育后，在读板器上进行化学发光检测，读取发光值(rlu)，按以下公式计算酶活性：酶活＝(rlu(sample)-rlu(blank))/(rlu(pos.ctrl)-rlu(blank))×100％；其中rlu(pos.ctrl)为空白对照品与ttk酶激酶反应的激酶读值，rlu(blank)为待测样品中未添加ttk酶时激酶读值。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：(1)本发明提供的ttk酶活性的快速检测方法利用ttk蛋白在分子水平可以将底物磷酸化的原理，结合adp-glotm这种灵敏度非常高的技术，直接测定反应中消耗的atp的量来定量反应的进程。实验表明，该方法体系稳定，测定数据准确度高。因此，该方法可应用于ttk靶点抑制剂的筛选和ttk靶点相关药物的筛选。(2)本发明的方法使整个反应在384孔板中进行，不涉及反复吸出和洗板过程，因此降低了检测过程中可能出现的操作误差，同时增加了通量，适用于结合高通量移液工作站设备进行大量的微孔板操作。(3)本发明的检测方法样本用量极低，步骤简单，整个检测过程可在一天内完成。(4)本发明的检测体系的z因子为0.56，表明本发明体系适用于高通量筛选。附图说明图1为通用激酶抑制剂星孢菌素(staurosporine)在实施例1的激酶体系中的测试结果；图1a、1b、1c分别为第一次、第二次、第三次测定星孢菌素在该激酶体系中的测试值。图2为本发明的检测体系的均一性评价结果示意图。图3为cc-671和cfi-402257两种化合物在本发明的激酶体系中的测试结果。具体实施方式下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。实施例1：ttk酶活性的快速检测方法本实施例中，ttk酶、mbp蛋白、5x多肽缓冲液和dtt均购于signalchem公司，adp-glotm激酶试剂购自promega公司，staurosprine购自mce公司。1、一种ttk酶活性的快速检测方法，包括以下步骤：(1)取待测样品、空白对照品、阳性对照品分别与ttk酶试剂、mbp蛋白/atp混合液共孵育进行激酶反应产生adp；待测样品、阳性对照品、ttk酶试剂、mbp蛋白/atp混合液均以缓冲液为溶剂，其中阳性对照品为通用激酶抑制剂星孢菌素溶解于缓冲液所形成的溶液，浓度为50μm-0.64nm；ttk酶试剂浓度为1.0-5.0ng/μl，待测样品浓度为50μm-0.64nm，mbp蛋白/atp混合液中mbp蛋白浓度为0.25mg/ml，atp浓度为125μm。空白对照为缓冲液。本实施例中，缓冲液包括40mmtris、20mmmgcl2、0.1mg/mlbsa和50μmdtt，缓冲液ph7.5。该反应体系共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为60-120min。(2)向步骤(1)的三组激酶反应体系中分别添加adp-glotm反应试剂共孵育，终止激酶反应并消耗完剩余atp；adp-glotm反应试剂与步骤(1)的激酶反应体系等体积，共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为30-60min。(3)向步骤(2)的三组反应体系中分别添加激酶检测试剂共孵育，使adp转化成atp，并读取新合成的atp的发光值rlu；该反应体系共孵育温度为25-30℃，共孵育时间为20-60min。(4)按酶活＝(rlu(sample)-rlu(blank))/(rlu(pos.ctrl)-rlu(blank))×100％计算ttk酶的活性；其中rlu(pos.ctrl)为空白对照品与ttk酶激酶反应的激酶读值，rlu(blank)为待测样品中未添加ttk酶时激酶读值。2、本发明的ttk酶活性的快速检测方法可应用于ttk靶点抑制剂的筛选和ttk靶点相关药物的筛选。3、一种ttk靶点抑制剂的筛选试剂盒，包括：缓冲液、空白对照品、阳性对照品、ttk酶试剂、mbp蛋白/atp混合液、adp-glotm反应试剂和激酶检测试剂，所述缓冲液包括40mmtris、20mmmgcl2、0.1mg/mlbsa和50μmdtt，缓冲液ph＝7.5；所述空白对照品为缓冲液；所述阳性对照品为通用激酶抑制剂星孢菌素溶解于缓冲液所形成的溶液，其浓度为50μm-0.64nm；所述ttk酶试剂为ttk酶溶解于缓冲液所形成的溶液，浓度为1.0-5.0ng/μl；所述mbp蛋白/atp混合液为atp和mbp蛋白溶解于缓冲液所形成的溶液，atp浓度为125μm，mbp蛋白浓度为0.25mg/ml。4、应用上述的ttk靶点抑制剂的筛选试剂盒筛选ttk靶点抑制剂的方法，步骤如下：步骤1：(1)在冰上解冻ttk酶、mbp蛋白、5x缓冲液(200mmtris,ph7.5；100mmmgcl2；0.5mg/mlbsa)和dtt(0.1m)，并且以上试剂在整个实验过程中需要一直放置在冰上；adp-glotm激酶试剂中的atp也需要在冰上溶解，并且在整个实验过程中需要一直放置在冰上。(2)将5x的缓冲液用去离子水稀释至1x，并在其中加入dtt，配成dtt浓度为50μm的1x缓冲液。(3)配制待测样品：取待测样品用dmso溶解，化合物的dmso浓度不能大于5％，实验最终dmso浓度不能大于1％；然后用1x缓冲液进一步稀释待测样品溶液，使其浓度为50μm-0.64nm。(4)配制阳性对照品：取星孢菌素用dmso溶解，星孢菌素的dmso浓度不能大于5％，实验最终dmso浓度不能大于1％；然后用1x缓冲液进一步稀释星孢菌素溶液，使其浓度为50μm-0.64nm。(5)取待测样品、空白对照品、阳性对照品各1μl，加入到微孔板的三个不同的孔中，微孔板在离心机上1000转离心1分钟，使待测化合物和阳性对照聚集到微孔板底部。其中空白对照为1x缓冲液。步骤2、(1)ttk酶完全解冻后，使用1x的缓冲液将ttk酶稀释到5ng/μl。(2)向步骤1中的三个微孔中各加入2μlttk酶试剂，此时每孔中ttk酶的酶量为10ng；空白对照孔加入2μl/孔1x缓冲液；此步骤在冰上进行，加完后，微孔板在离心机上1000转离心1分钟。步骤3、(1)配置mbp蛋白/atp混合液：用1x缓冲液，将10mmatp稀释80倍配成atp缓冲液；用atp缓冲液将mbp蛋白(1mg/ml)进行4倍稀释配成mbp蛋白/atp混合液，此时atp浓度为125um，mbp蛋白浓度为0.25mg/ml。此步骤在冰上进行。(2)向步骤2的三个微孔中各加入2μlmbp蛋白/atp混合液，加完后微孔板1000转离心1分钟。步骤4、离心完毕后，给微孔板贴膜，压紧贴膜，25-30℃条件下共孵育60-120min。步骤5、(1)将需要用的adp-glotm反应试剂和激酶检测相关试剂平衡到室温，将10ml激酶检测缓冲液加入到激酶检测底物干粉中混合备用。多余的试剂分装-20℃保存。(2)步骤4的反应体系结束孵育后，取adp-glotm反应试剂5μl/孔分别加入到三个微孔中，微孔板离心，25-30℃条件下孵育30-60min。步骤6、步骤(5)结束孵育后，取激酶检测试剂10μl/孔分别加入到三个微孔中，微孔板离心，25-30℃条件下孵育20-60分钟；步骤7、步骤6结束孵育后，在读板器上进行化学发光检测，读取发光值(rlu)，按以下公式计算酶活性：酶活＝(rlu(sample)-rlu(blank))/(rlu(pos.ctrl)-rlu(blank))×100％；其中rlu(pos.ctrl)为空白对照品与ttk酶激酶反应的激酶读值，rlu(blank)为待测样品中未添加ttk酶时激酶读值。5、不同反应酶量的信号比测量按照上述反应体系，在反应过程中加入不同的反应酶量，测试信噪比。发现当酶用量为2-10ng/反应时，信噪比大于3倍以上，均满足初始反应要求。采用10ng每反应作为后续实验的反应条件。表1不同反应酶量的信号比测量结果6、不同反应时长的信号比测量当酶用量固定为10ng每反应时，采用不同的孵育时间，从30分钟到120分钟，逐步延长反应时间。结果发现当孵育时间从30分钟延长至120分钟，得到的信号信噪比逐渐增加，且均满足大于3倍信号测试要求。后续实验采用10ng每反应，120分钟作为反应时间做下游时间。表2不同反应时长的信号比测量结果平均化学发光读值本底平均化学发光读值信噪比30分钟23675714.1560分钟46526527.1390分钟892866013.53120分钟1324571818.457、阳性参考化合物测定当激酶反应时间为120分钟，反应酶量为10ng时，测定通用激酶抑制剂星孢菌素(staurosporine)在本激酶体系中的测试值，作为体系的阳性参考指标。如图1所示，独立检测三次星孢菌素在体系中的半数抑制浓度，分别为169.2nm、210.2nm和134.5nm。三次平行实验结果测定数据差异在三倍以内，认为测定数据准确度较高，实验体系稳定。测定数据可作为后续实验的阳性参考。8、体系均一性评价z-因子(z-factor)是一个关于信号区间和变异的组合，它已成为评估测试方法质量的主要参数。z-因子是统计效应大小的度量，它的提出是用来判断高通量筛选中测定的反应强度是否达到进一步研究的要求。z-因子的值是一个用于区分信号与背景群体的相对指标。其为一个没有量度的参数，其范围可以从“1到小于0”。当z-因子等于零时，信号与背景开始重叠。一般而言，可以接受的z-因子应大于0.4。在本发明中我们测定信号和背景的z因子指标。测得z因子为0.56，说明本发明体系适用于高通量筛选(如图2所示)。实施例2：本发明的检测方法对cc-671和cfi-402257两种化合物进行ttk靶点抑制剂的筛选分别取cc-671和cfi-402257按照实施例1的方法实验，并计算两种化合物对ttk的酶活和ic50值，如图3所示。cc-671和cfi-402257的ic50分别为4.26nm、0.18nm。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12