一种快速检测产四环素类药物失活酶的菌株的方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种快速检测含有四环素类药物失活酶的菌株的方法。

背景技术：

20世纪40年代被发现的四环素类抗生素是一类抑制细菌蛋白合成的广谱抗生素，可用于治疗多种细菌感染，具有显著的治疗效果，因此在临床上具有非常重要的作用。然而，随着细菌不断的进化，一些细菌能够对四环素类抗生素产生耐药性，即随着四环素耐药菌的出现，导致许多临床使用四环素类药物治疗失败的案例出现。其中四环素耐药机制有许多，包括外排泵机制、产生灭活酶等。

目前，聚合酶链式反应是检测四环素耐药菌株的一种常用的分子生物学方法，因其检测准确，因此被广泛使用。但是，该方法的一个明显不足是，技术要求较高，需要特殊的试剂和专业人员操作，不能广泛应用于基层单位。

尽早发现携带含有四环素类药物失活酶的菌株并采取有效措施，对医院感染控制及临床流行病学检测具有极其重要意义。因此，研究开发操作简单、分析快速、适用范围广、准确性和特异性高的含有四环素类药物失活酶的菌株的检测方法具有迫切需求。

技术实现要素：

为克服现有技术中的不足，本发明提供了一种快速检测含有四环素类药物失活酶的菌株的方法。

本发明同时保护依上述方法制备而成的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测产四环素类药物失活酶的菌株的方法，包括如下步骤:

s1.制备涂布指示菌的培养基，其中，指示菌为加入四环素类抗生素后不能生长或显著抑制生长的菌株；

s2.将四环素类抗生素溶液分别与待测菌株、阴性对照菌株共同孵育；

s3.在步骤s1的培养基上打孔并封底，将步骤s2孵育后的溶液进行离心，加入孔内孵育，对产生的抑菌圈进行对照，同时设置空白组；

若待测菌株的抑菌圈为零，该待检测菌为产四环素类药物失活酶的菌株；

若待测菌株的抑菌圈与空白组与阴性对照组相同，该待检测菌不含有四环素类药物失活酶的菌株。

优选地，步骤s1中培养基为mh培养基。

优选地，步骤s2中孵育的时间为6~10小时。

优选地，步骤s3中孵育的时间为16~20小时。

优选地，四环素类抗生素溶液的适宜浓度采用如下方法进行判定：将四环素类抗生素溶液进行梯度稀释，在涂布有指示菌的培养基中，每一孔加20微升，然后孵育16~18小时，观察到有直径为8mm-15mm的组别所对应的抗生素浓度即为适宜浓度。

优选地，步骤s3中在步骤s1的培养基中的指示菌培养至对数期，使指示菌的终浓度为10⁸cfu/ml。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

本发明的检测方法操作简便、快速，准确性和特异性高。相比较于传统的pcr方法，本发明所公开的方法的检测不再需要价格昂贵的仪器设备与专业的生物技术人员，同时，本发明的检测方法的准确性和特异性与pcr方法相当。

附图说明

图1是实施例1中构建的快速检测产四环素类抗生素失活酶的菌株的方法流程示意图。

图2-a、2-b、2-c、2-d、2-e、2-f、2-g分别用四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素、伊拉瓦环素溶于无菌水作为实验药物的实验结果，每个药物都分别做了空白对照组（图中为“blank”），阳性对照组（图中为“x+”），阴性对照组（图中为“x-”），分别附上以不同药物作为实验药物的检测结果照片图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂，方法和设备为本技术领域常规试剂，方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测方法的构建

图1是本发明快速检测产四环素类药物失活酶的菌株的方法流程示意图。该方法包括以下步骤：

步骤1：将四环素类抗生素溶于含有无菌水的离心管中，并对离心管进行涡旋。

四环素类抗生素是商品化的试剂，将四环素类抗生素放置在含有无菌水的离心管进行涡旋，主要是将四环素类抗生素中的检测试剂均匀扩散在无菌水中。

在本实施例中，将四环素类抗生素溶于含无菌水的离心管中，并对离心管进行涡旋的步骤包括：将四环素类抗生素溶于含有800微升无菌水的2毫升离心管中，制备三管并对离心管涡旋10～20秒钟。

优选地，对溶有四环素类抗生素的离心管涡旋15秒钟。

步骤2：刮一接种环的待检测菌菌苔、一接种环的e.coliatcc25922菌苔、100μl的mh肉汤分别放置在步骤1所述的离心管中共同孵育。

在本实施例中，刮一接种环的待检测菌菌苔放置在离心管中共同孵育的步骤包括：刮一接种环的待检测菌菌苔放置在离心管中共同孵育8h，主要是让待检测菌产生的基因与四环素类抗生素充分作用。

优选地，将待检测菌菌苔放置在离心管中共同孵育8h。

步骤3：在高压灭菌后的mh琼脂培养基上，用无菌6mm打孔器分别打三个孔，并进行封底，然后涂布培养至对数期的嗜热脂肪芽孢杆菌（同样可采取其他指示菌）。

进一步的，四环素类抗生素能够抑制嗜热脂肪芽孢杆菌生长，导致其不能生长。

在本实施例中，在高压灭菌的mh琼脂培养基，冷却至40～45℃，倒入平皿中晾干，涂布培养至对数期的嗜热脂肪芽孢杆菌。

优选地，冷却至40℃，并涂布培养至对数期的嗜热脂肪芽孢杆菌，使嗜热脂肪芽孢杆菌的终浓度为10⁸cfu/ml。

步骤4：将空白对照组、待测组、阴性对照组中相应的溶液分别加入涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上对应的6mm已封底的孔中，60±5℃孵育18小时。

优选地，加入在涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的琼脂培养基上，并处于温度为60℃的环境中孵育8小时。值得注意的是，60℃的温度为嗜热脂肪芽孢杆菌的最适生长温度，且嗜热脂肪芽孢杆菌处于常温不生长。

步骤5：若测试点的抑菌圈大小直径几乎为零，则判定该待检测菌是产四环素类药物失活酶的菌株。

若待检测菌携带含有使四环素类药物失活酶的菌株的细菌，则经过步骤2的孵育后会将离心管中的四环素类抗生素的成分降解，因此若携带含有四环素类药物失活酶的菌株，四环素类抗生素与待测菌液混合液不能使涂布于为嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基的x+出现抑菌圈。

步骤6：若待测菌并不是含有四环素类药物失活酶的菌株，则涂布于嗜热脂肪芽孢杆菌的琼脂培养基的测试点会出现抑菌圈，且抑菌圈大小与空白对照组、阴性对照组类似，因此判定该待检测菌不是四环素类药物失活酶的菌株。

若待检测菌不是产四环素类药物失活酶的菌株，则离心管中的四环素类抗生素与无菌水混合液不会被降解，因此将四环素类抗生素与待测菌混合孵育后，加入在6mm的已封底的孔中时，会出现与空白对照组、阴性对照组大小相似的抑菌圈。

相比较于传统的pcr分子学方法，本发明的方法的准确性和特异性与pcr方法的保持一致，本发明的检测设备花费比传统方法所需的仪器设备花费更小，要求更低，更加适用于基层单位的相关检测，结果判读也更易于判断。

实施例2

本实施例采用大肠杆菌lhm10-1作为实验菌株进行方法示例：

大肠杆菌lhm10-1于2017年7月从江西省樟树市某猪场分离得到，能够显著降解四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素和伊拉瓦环素。

上述大肠杆菌（escherichiacoli）lhm10-1菌株于2019年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为gdmccno：60622。保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

（1）设置一个空白对照（图1中“blank”位置），一个阳性测试组（图1中正号“x+”位置），一个阴性对照组（图2中“x-”位置），其中阴性对照组为一株经过pcr鉴定无含有使四环素类药物失活酶的菌株的大肠杆菌标准菌株atcc25922（购自中国微生物菌种保藏中心），经过pcr得出实验结果：上述阴性对照x-为不产生四环素类药物失活酶的菌株，x+是产生四环素类药物失活酶的菌株（大肠杆菌lhm10-1）。

（2）分别将四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素、伊拉瓦环素置于含有800微升无菌水的2毫升离心管中涡旋15秒钟，每种实验药物制作三管药水，然后分别刮一接种环菌苔置于四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素、伊拉瓦环素各自的阳性对照组、阴性对照组，其中空白组只为四环素+无菌水+mh肉汤、金霉素+无菌水+mh肉汤、土霉素+无菌水+mh肉汤、多西环素+无菌水+mh肉汤、米诺环素+无菌水+mh肉汤、替加环素+无菌水+mh肉汤、伊拉瓦环素+无菌水+mh肉汤，每种药物的三个离心管分别为：空白对照组、阴性对照组、阳性对照组，然后放入37℃恒温培养箱（3）在高压灭菌的mh琼脂培养基（购买自广东环凯微生物科技有限公司）冷却至40℃时用移液枪加20ml到无菌培养皿中，自然晾干30分钟，涂布培养至对数期的嗜热脂肪芽孢杆菌标准菌株atcc7953（购自中国微生物菌种保藏中心），使其终浓度为10⁸cfu/ml，制备得到含有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基。

（4）将与待测菌苔、25922大肠杆菌标准菌菌苔孵育8h后的四环素的空白对照、阴性对照、阳性对照；金霉素的空白对照、阴性对照、阳性对照；土霉素的空白对照、阴性对照、阳性对照；多西环素的空白对照、阴性对照、阳性对照；米诺环素的空白对照、阴性对照、阳性对照；替加环素的空白对照、阴性对照、阳性对照；伊拉瓦环素的空白对照、阴性对照、阳性对照分别用移液枪吸取各管的20μl到嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上对应的孔中，每个药物一个mh琼脂培养基，每个mh琼脂培养基上有三个6mm并封底的孔，加入完成后，就放入60℃恒温培养箱中孵育16小时后观察其抑菌圈大小。

实验结果如图2-a、2-b、2-c、2-d、2-e、2-f、2-g所示，阳性对照组在涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上没有出现明显的抑菌圈，即含有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基没有出现明显抑菌圈；阴性对照组及空白对照组在嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上出现了明显的抑菌圈，即空白对照组、阴性对照组所对应的孔发散出了抑菌圈；即涂布有嗜热脂肪芽孢杆菌的mh琼脂培养基上有出现抑菌圈。

通过上述实验，证明实验组的菌株大肠杆菌lhm10-1是产四环素类药物失活酶的菌株，经过pcr鉴定是含有四环素类药物失活酶的菌株，两种方法实验结果保持一致。