用于检测甲基化对miRNA和mRNA结合影响的方法与流程

本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法。

背景技术：

rna的甲基化，包括mrna、lncrna和mirna等的甲基化，是哺乳动物体内存在的一种普遍的rna修饰方式，参与多种生物过程的表观遗传调控，比如mrna的稳定性、可变剪接和蛋白翻译等生物过程。rna的甲基化对细胞状态调节、性别决定和发育至关重要，rna的甲基化的失调与肥胖、癌症等人类疾病密切相关。

微小rna(mirna)是一类由内源基因编码的长度约22nt的单链rna，在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶基因mrna的碱基特异性互补配对，引起靶基因降解或者抑制其翻译，从而对靶基因进行转录后的表达调控。目前mirbase数据库收录了人类1881条mirna前体序列和2588条mirna成熟序列，这些mirna却调控了至少60％人类编码蛋白基因的表达。mirna的调控作用也具有高度的保守性，参与调控机体生长、发育和代谢等多种生命活动，mirna的表达失调与癌症、心血管疾病、化学性肝损伤等人类疾病的发生发展密切相关。因此，研究甲基化对mirna和靶基因mrna序列结合作用的影响具有非常重要的意义。

目前研究甲基化对mirna和mrna结合作用影响的检测只有双荧光素酶报告基因实验一种方法，主要是通过构建靶基因mrna双荧光素酶报告基因载体联合mirna模拟物转染细胞，裂解细胞后提取上清液检测荧光素酶的表达情况来判断甲基化对mirna和mrna结合作用的影响。但该技术操作繁琐复杂，所需试剂种类多，耗时长。

技术实现要素：

本申请提供一种用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法，具体地，本申请提供一种基于荧光的用于检测甲基化对mirna和mrna结合作用影响的可视化方法，以解决上述至少一个问题。

根据本申请实施例的提供的一种用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法，其包括：

比较第一反应体系和第二反应体系的荧光强弱；

第一反应体系中含有mrna与mirna，其中，mrna与mirna均未甲基化；

第二反应体系中含有mrna与mirna，其中，mrna与mirna中的任意一者具有甲基化位点；

第一反应体系和第二反应体系中的mrna和mirna均标记有荧光染料；

若第二反应体系的结合复合物的荧光值小于第一反应体系的结合复合物的荧光值和/或第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值大于第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值，则指示甲基化减弱了mirna与mrna的结合；

若第二反应体系的结合复合物的荧光值与第一反应体系的结合复合物的荧光值相同和/或第二反应体系的游离核苷酸单体的荧光值与第一反应体系的游离核苷酸单体的荧光值相同，则指示甲基化不影响mirna与mrna的结合。

也即是，本申请提供了一种新的用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法，通过比较第一反应体系以及第二反应体系的荧光强弱，实现可视化检测甲基化对mirna和mrna结合作用的影响，同时该方法还具有实现简单、反应灵敏、以及可快速高效的得到测试结果的优点。

另外，根据本申请实施例的用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法还具有如下附加的技术特征：

本申请示出的一些实施例中，第一反应体系以及第二反应体系中，mrna与mirna的摩尔比均为1:1。

上述比例条件下，可保证mrna与mirna可以达到充分结合的条件且避免mrna或mirna过多，导致的游离的mrna或mirna多，影响荧光强度导致影响可视化检测结果或判断。

本申请示出的一些实施例中，第一反应体系和第二反应体系中均包括depc-h2o以及bingdingbuffer。

其中，depc-h2o的引入有效防止mrna与mirna的降解，影响荧光强度，导致检测结果不准确的问题。

可选地，第一反应体系包括体积比依次为8:1:1:10的bindingbuffer、400nm的mrna、400nm的mirna以及depc-h2o，第二反应体系包括体积比依次为8:1:1:10的bindingbuffer、400nm的mrna、400nm的mirna以及depc-h2o。

保证第一反应体系以及第二反应体系中mrna与mirna的活性，同时防止mrna与mirna降解，避免处甲基化以外的其他因素的干扰，保证较佳的状态便于结合，以判断甲基化对mirna和mrna结合影响。

可选地，bindingbuffer由100mm的ph7.2-7.4的hepesbuffer、50％的glycerol、2m的kcl和1m的mgcl2等体积混合所得。

例如以20μl反应体系为例，bindingbuffer由100mmhepesbuffer(ph7.3，2μl)，50％glycerol(2μl)，2mkcl(2μl)和1mmgcl2(2μl)混合所得。

可选地，第一反应体系以及第二反应体系均由以下方式获得：

将mrna与mirna用depc-h2o稀释后，于94-96℃加热1.5-2.5min，随后放冰上冷却1.8-2.5min后添加于bingdingbuffer中孵育所得。

通过先使用depc-h2o稀释，溶解mirna和mrna且抑制mirna和mrna的降解，保证mirna和mrna结合的稳定性。

可选地，孵育在24-26℃保温18-22min。例如孵育在24℃、24.5℃、25℃、25.5℃或26℃中的任一点或任意两点之间的范围值内保温18-22min，使mirna和mrna充分结合。

可选地，本申请中，第一反应体系和第二反应体系的荧光的获得方式如下：

将第一反应体系以及第二反应体分别电泳后，经成像系统成像所得。

换言之，将第一反应体系中的mrna与mirna结合反应后作为第一产物，以及将第二反应体系中的mrna与mirna结合反应后作为第二产物，进而将第一产物以及第二产物电泳，经电泳、成像，获得第一产物对应的第一荧光条带、以及第二产物对应的第二荧光条带，进而对比第一荧光条带与第二荧光条带的荧光强弱，判断甲基化对mirna和mrna结合影响。

可选地，电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

可选地，电泳采用浓度为12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，非变性聚丙烯酰胺凝胶由体积比依次为7.5：4.5：1.5：1.5:0.105:0.075的水、40％acrylamide/bis溶液、5×tbe缓冲液、甘油、过硫酸铵、temed混合所得。

例如以15μl反应体系为例，非变性聚丙烯酰胺凝胶由水(7.5ml)，40％acrylamide/bis溶液(4.5ml)，5×tbe缓冲液(1.5ml)，甘油(1.5ml)，10％过硫酸铵(0.105ml)，temed(0.075ml)混合所得。

可选地，电泳的上样缓冲液为包含有15％ficoll和0.4％orangeg的水溶液。

可选地，聚丙烯酰氨凝胶电泳的缓冲液为0.5×tbe缓冲液，电泳在4℃且恒压为100v的条件下进行3小时。

需说明的是，本申请中，mirna包括但不限定于has-mir-1910-5p、hsa-mir-589-5p、hsa-mir-204-3p、hsa-mir-181c-5p等。mrna包括但不限定于acsl3、acsl1、acsl5等。

本申请示出的一些实施例中，mirna的核苷酸序列如seqidno：1或seqidno：2所示，其中，如seqidno：2所示的mirna的甲基化位点在第6位。

本申请示出的一些实施例中，mrna的核苷酸序列如seqidno：3或seqidno：4所示，如seqidno：3所示的mirna的甲基化位点在第18位。

本申请提供的实施例中，荧光染料包括发射波长在650-850nm之间的荧光染料。换言之，发射波长在650-850nm之间的荧光染料均可以用于标记mirna和mrna。

发射波长在650-850nm之间的荧光染料包括但不限定于irdye800、cy5、cy5.5、thiadicarbocyanine、irdye680lt、alexa750、alexa660、alexa647、dy750、wellredd2dye、wellredd3dye和wellredd4dye等。

用于标记mirna和用于标记mrna的荧光染料可以相同，也可以不同，可选地，用于标记mirna和用于标记mrna的荧光染料不同，具体为用于标记mirna的荧光染料和用于标记mrna的荧光染料的发射波长不同，进而在不同的波长下检测各探针的迁移情况。

本申请示出的一些实施例中

标记mirna的荧光染料为irdye荧光染料；

可选地，标记mirna的荧光染料为irdye800荧光染料；

可选地，标记mrna的荧光染料为cy荧光染料；其包括cy5、cy5.5等。

可选地，标记mrna的荧光染料为cy5.5荧光染料。

换言之，标记甲基化或未甲基化的mrna寡核苷酸序列均采用irdye荧光染料，标记甲基化或未甲基化的mirna寡核苷酸序列均采用cy荧光染料。其中，cy5.5荧光染料的发射波长在700nm附近，irdye800荧光染料的发射波长在800nm附近，因此可以分别在700nm和800nm波长下检测并获得各探针的迁移情况。

可选地，荧光染料标记在mirna的5’端或3’端、以及mirna的5’端或3’端。

本申请示出的一些具体实施例中，荧光染料标记在mirna的5’端、以及mirna的5’端。

本申请示出的一些实施例中，用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法还包括：设置含有mrna或mirna的荧光对照体系，其中荧光对照体系包括：

含有mrna的第三反应体系、含有mirna的第四反应体系、含有甲基化位点的mrna的第五反应体系，以及含有具有甲基化位点的mirna的第六反应体系。

换言之，将荧光对照体系作为第一反应体系和第二反应体系的荧光强弱的对照组。

由于荧光对照体系仅含有mrna和mirna中的任一种，为了使荧光对照佳，荧光对照体系中可适应性的利用depc-h2o补充未添加的mrna或mirna的体积，保证第三反应体系、第四反应体系、第五反应体系，以及第六反应体系的总体积与第一反应体系以及第二反应体系的总体积相同。

其中，第三反应体系、第四反应体系、第五反应体系，以及第六反应体系的荧光的获得方式与第一反应体系以及第二反应体系的荧光的获得方式相同。

本申请的特点和有益效果是：目前检测甲基化对mirna和mrna结合作用影响的方法只有双荧光素酶报告基因实验一种方法，但该技术操作繁琐复杂，所需试剂种类多，耗时长。本申请通过荧光染料分别标记未甲基化的mirna和mrna寡核苷酸序列，以及甲基化的mirna或mrna寡核苷酸序列，混合反应后经非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，使用成像系统直接观测甲基化对mirna和mrna结合作用的影响。本申请具有操作简便、时间短、灵敏度高和可视化等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为acsl3甲基化对acsl3与has-mir-1910-5p结合作用的影响图；

图2为has-mir-589-5p甲基化对has-mir-589-5p与acsl1结合作用的影响图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请中，成像例如可以采用成像仪，具体例如为odsseyclx红外成像系统，在该成像系统中，直接观察700nm和800nm双荧光通道下的荧光条带。

需要说明的是，成像系统的检测波长与具体的荧光染料相关，可参考相关技术，在此不做赘述。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例对acsl3甲基化对acsl3与has-mir-1910-5p结合作用的影响进行检测，涉及的材料有：

mirna寡核苷酸序列：5’端标记irdye800的has-mir-1910-5p寡核苷酸序列，序列为：ccaguccugugccugccgccu(seqidno：2)。

mrna寡核苷酸序列：5’端标记cy5.5的acsl3寡核苷酸序列，序列为：uguuaggagcagccaggacugu(seqidno：3)。

甲基化的mrna寡核苷酸序列：5’端标记cy5.5的甲基化acsl3寡核苷酸序列，序列为：uguuaggagcagccaggacugu(seqidno：3，其中下划线标记的a进行m6a甲基化修饰，也即是第18位进行m6a甲基化修饰)。

仪器：高速离心机，普通pcr仪，odsseyclx红外成像系统，用于聚丙烯酰胺凝胶的垂直电泳装置，包括垫片、玻璃板、梳子和凝胶浇注架。

溶液：

bindingbuffer的组成成分包括(以20μl反应体系为例)：100mmhepesbuffer(ph7.3，2μl)，50％glycerol(2μl)，2mkcl(2μl)和1mmgcl2(2μl)。

非变性聚丙烯酰氨凝胶组成成分包括(以15ml溶液体积为例)：水(7.5ml)，40％acrylamide/bis溶液(4.5ml)，5×tbe缓冲液(1.5ml)，甘油(1.5ml)，10％过硫酸铵(0.105ml)，temed(0.075ml)。

6×上样缓冲液：包含15％ficoll和0.4％orangeg的水溶液。

电泳缓冲液：0.5×tbe缓冲液。

具体按照以下步骤进行：

1.将合成好的荧光标记的寡核苷酸探针粉末加入(10×nmole数)μl的depc-h2o，成为100μm的储液。随后95℃加热2分钟，放冰上冷却2min。最后将储液用depc-h2o稀释250倍成为400nm溶液待用。

2.配制非变性聚丙烯酰氨凝胶，将水(7.5ml)，40％acrylamide/bis溶液(4.5ml)，5×tbe缓冲液(1.5ml)，甘油(1.5ml)，10％过硫酸铵(0.105ml)和temed(0.075ml)至于50ml离心管混合均匀，随后轻轻的加入7.25cm×10cm×1.5mm的制胶盒并插入10齿梳子。室温静置30分钟。

3.将非变性聚丙烯酰氨凝胶胶板装入垂直电泳系统，加入0.5×tbe缓冲液，4℃恒压80v预电泳30分钟。

4.按照如下表1中的反应体系进行mirna和mrna的结合反应，总体积20μl：

表1结合反应原料组成

25℃孵育20分钟。

5.上样前，用1ml注射器轻轻冲洗胶孔。然后向20μl结合反应体系中加入4μl6×上样缓冲液，上样。

6.4℃恒压100v预电泳3小时。

7.电泳结束后用水轻轻冲洗胶板，然后直接置于odsseyclx红外成像系统上，观测700nm和800nm下的荧光强度。

结果如图1所示，图1中，第1泳道是irdye800标记的has-mir-1910-5p，第2泳道是cy5.5标记的未甲基化acsl3，第3泳道是cy5.5标记的甲基化acsl3，第4泳道是irdye800标记的has-mir-1910-5p和cy5.5标记的未甲基化acsl3及其结合复合物，第5泳道是irdye800标记的has-mir-1910-5p和cy5.5标记的甲基化acsl3及其结合复合物。

其中，黑色实体箭头指示的是acsl3与has-mir-1910-5p的结合复合物，空心箭头指示的是游离的acsl3和has-mir-1910-5p单体。“+”表示添加，“-”表示未添加。

根据图1，将第5泳道(lane5)的游离mrna条带的荧光强度与第4泳道(lane4)的游离mrna条带的荧光强度相比，发现第5泳道的荧光强度强于第4泳道，说明本申请成功检测出acsl3的甲基化会减弱acsl3和has-mir-1910-5p的结合作用。

实施例2

本实施例对hsa-mir-589-5p甲基化对hsa-mir-589-5p与acsl1结合作用的影响进行检测，涉及的材料有：

mirna寡核苷酸序列：5’端标记irdye800的hsa-mir-589-5p寡核苷酸序列，序列为：ugagaaccacgucugcucugag(seqidno：2)。

甲基化mirna寡核苷酸序列：5’端标记irdye800的甲基化hsa-mir-589-5p寡核苷酸序列，序列为：ugagaaccacgucugcucugag(seqidno：2，其中，下划线标记的a进行m6a甲基化修饰)。

mrna寡核苷酸序列：5’端标记cy5.5的acsl1寡核苷酸序列，序列为：augcucuuggacucgguucucc(seqidno：4)。

仪器：同实施例1。

溶液：同实施例1。

具体按照以下步骤进行：

第1步至第3步的操作方法同实施例1。

4.按照如下表2中的反应体系进行mirna和mrna的结合反应，总体积20μl：

表2结合反应原料组成

25℃孵育20分钟。

第5步至第7步的操作方法同实施例1。

结果如图2所示，图中第1泳道是cy5.5标记的acsl1，第2泳道是irdye800标记的未甲基化has-mir-589-5p，第3泳道是irdye800标记的甲基化has-mir-589-5p，第4泳道是irdye800标记的未甲基化has-mir-589-5p和cy5.5标记的acsl1及其结合复合物，第5泳道是irdye800标记的甲基化has-mir-589-5p和cy5.5标记的acsl1及其结合复合物。

其中，黑色实体箭头指示的是has-mir-589-5p与acsl1的结合复合物，空心箭头指示的是游离的has-mir-589-5p和acsl1单体。“+”表示添加，“-”表示未添加。

根据图2，将第5泳道(lane5)的游离mrna条带的荧光强度与第4泳道(lane4)的游离mrna条带的荧光强度相比，发现第5泳道的荧光强度强于第4泳道的荧光强度，说明本申请成功检测出has-mir-589-5p的甲基化会减弱has-mir-589-5p和acsl1的结合作用。

综上，本申请提供一种用于检测甲基化对mirna和mrna结合影响的方法，其基于荧光标记甲基化或未甲基化的mirna和mrna，以达到可视化检测甲基化对结合作用影响目的，实现了操作简单、反应灵敏、快速高效且可视化的甲基化影响检测。

以上仅为本申请的可选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。