专利名称：一种高通量农杆菌介导的玉米基因原位转化方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米转基因方法，尤其涉及农杆菌介导的玉米基因原位转化方法。
背景技术：
玉米(Zea mays L.)是重要的粮食、饲料和工业原料兼用作物，是我国和世界主要的农作物之一。随着工业和畜牧业的发展，以及世界人口的增长，玉米在农业生产中的地位越来越重要。2003年以来，我国的玉米播种面积和产量呈现出不断增长的趋势，但与我国的玉米需求量还有较大缺口，尤其与美国等玉米生产大国还有较大的差距。因此，不断增长的玉米需求量对我国的玉米农业生产提出了更高的要求。目前，我国的玉米生产仍以常规杂交育种为主体，因其育种周期长、种质资源匮乏等缺点，这就对我国的玉米育种工作者提出了前所未有的挑战。因此，开展玉米转基因技术研究是我国目前玉米生产现状的迫切需求。转基因技术克服了物种间的限制，使优良的基因在动植物和微生物之间相互交流，弥补了常规杂交育种种质资源匮乏的不足。将转基因技术与玉米常规育种相结合，能尽快培育出符合育种目标的玉米新品种，显著的缩短了玉米育种周期。自Frorrn等人于1990 首次报道了第一例可育的转基因玉米以来，全世界已有多个转基因玉米品种被批准进入商业化生产。通过转基因技术已经培育了一大批抗除草剂、抗旱、抗虫、耐盐等优良的转基因玉米品种。目前，在玉米转基因技术研究上，已建立了多个转化方法，包括基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法、花粉管通道法、超声波法、显微注射等方法。但在玉米转基因过程中应用的比较成熟的是农杆菌介导法和基因枪法。而这些方法在组织培养、转化效率以及受体基因型等方面存在着各种不足，难以满足目前生产上应用的玉米骨干自交系的转化需求。 因此，发展和建立一种简便高效的不需要组织培养和不受玉米基因型限制的转基因技术显得尤为迫切。原位转化(In planta)，又叫活体转化、整体转化，是一种农杆菌介导的在植物活体状态下实现目的基因整合的转基因方法，其主要特征是不需要经过繁琐组织培养和继代培养过程而直接获得转化种子，显著缩短了转基因育种周期。原位转化方法是双子叶植物拟南芥遗传转化广泛采用的一种方法，现已成功应用到芸薹属作物上。目前，该技术在禾本科植物玉米的遗传转化中的应用并不成熟。本发明方法利用特制的电动注射仪将含有目的基因的农杆菌转化液注入到玉米雌穗最内层苞叶空隙处，并对转化液各参数进行了优化， 获得了较高的转化效率。本发明方法效率高、简便易行、成本低，适用于不同玉米种质的遗传转化。
发明内容
本发明解决的问题在于改进现有的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，提供一种简便高效的玉米转基因技术。本发明的具体方案为
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—种高通量农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，农杆菌菌株为 LBA4404或EHA105，质粒为PCAMBIA1301，筛选标记为除草剂，包括以下步骤步骤1 对农杆菌进行增殖培养，病毒基因诱导培养后，配制农杆菌转化液；步骤2 将步骤1的农杆菌转化液注入玉米雌穗最内层苞叶的空隙处，浸泡雌花序一定时间后进行授粉；步骤3 收获种子播种后，对幼苗进行除草剂抗性筛选；步骤4 对具有除草剂抗性的植株进行PCR检测筛选。上述步骤1的增殖培养方法为将冻存的农杆菌株接种于含50mg/L卡那霉素和 50mg/L利福平的YEP平板上，于避光培养2d后，从YEP平板上挑取单菌落接种于含上述抗生素的YEP液体培养基中J8°C，230rpm培养16_24h ；吸取上述过夜培养物按1 50 的比例接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中扩大培养，280C 230rpm振荡培养4_6h， 至 0D600 值为 0. 6-0. 8。上述步骤1的病毒基因诱导培养方法为经增殖培养的农杆菌菌液离心后收集菌体，按照离心前菌液体积1 50的比例，用AB诱导液悬浮菌体，然后于条件下 150-180rpm震荡培养12h，进行农杆菌的Vir基因诱导培养；所述的AB诱导培养液含3g/ L K2HP04、lg/L NaH2P04、lg/L NH4C1、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 15g/L KCl、0.01g/L CaCl2, 0. 0025g/L FeS04 ·7Η20、0. 5g/L MES、2mM Na3P04、5g/L蔗糖、5g/L 葡萄糖、IOOuM 乙酰丁香酮，pH 为 5. 6。上述步骤1的配制农杆菌转化液为将经病毒基因诱导培养后的农杆菌菌液离心后，用MS转化液重新悬浮菌体，转化液0D600值调整为0. 8-1. 0，此菌液即为农杆菌转化液； 其中，MS 转化液为组分为:1/4MS,2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2， 4-D、IOOuM 乙酰丁香酮，pH 为 5. 8。进一步，步骤2的农杆菌转化液在注入玉米雌穗最内层苞叶的空隙之前，添加 0. 03% -0. 05%表面活性剂Silwet L-77 ；注射时使用电动注射仪；玉米雌穗在抽丝前用纸袋套住，于转化液注入24h后进行授粉。上述电动注射仪包括转化液容器、压力电泵、压力控制阀、塑料软管、注射控制阀、注射针头；压力电泵位于转化液容器底部并和塑料软管相连；压力电泵在压力控制阀的控制下，将转化液容器中的转化液压入塑料软管；塑料软管一端连接压力电泵，另一端通过注射控制阀连接注射针头；注射控制阀为按压式，按压打开注射控制阀，放开关闭注射控制阀；打开注射控制阀，被压力电泵压入塑料软管中的转化液通过注射针注射。本发明的有益效果包括1.本发明在进行农杆菌转化液注入到玉米雌穗最里层苞叶时，用电动注射仪取代了手动注射器，极大地提高了工作效率。该方法每人每天完成6000-8000植株的转化，可充分利用玉米盛花期进行授粉，提高了玉米植株的结籽率，为较高的遗传转化效率提供了保障。另外，电动注射仪压力均勻，对玉米雌穗损伤较手动注射要小，在一定程度上保证了转化效率。2.原位转化方法在模式植物拟南芥中应用非常广泛，在农杆菌浸泡花序时，采用真空辅助处理，能显著提高转化效率。但真空处理并不能应用于玉米这种花器较大的植物。 该方法在农杆菌转化液中添加适宜浓度的表面活性剂Silwet L-77，增强玉米雌花序对农杆菌的吸附能力。同时使农杆菌转化液与玉米花器的各个部分充分接触，为农杆菌中T-DNA 高效的整合提供了条件。3.玉米植株授粉后，可直接收获种子，不需经过繁琐的组织培养和植株再生过程， 显著地缩短了玉米转基因周期，加快了玉米转基因育种进程。4.本发明适合于不同的玉米品种，转化效率不会受到基因型的限制，可满足目前生产上应用的玉米骨干自交系的转化要求，简单高效。本发明仅需简单的设备和常规试剂， 可一次性完成大规模的植株转化。5. T1代玉米转基因植株的筛选采用除草剂喷洒2-3叶期幼苗，不依赖于抗生素筛选，操作简单、成本低。
图1是本发明电动注射仪结构示意图。图2是本发明PCR检测抗性植株结果图。
具体实施例方式下面将通过具体实例介绍本发明具体实施过程。1.材料和方法1. 1玉米品种品种为目前生产上应用的玉米骨干自交系aieng58，但本发明适用的玉米品种没有具体限制。1. 2农杆菌菌株及外源基因农杆菌菌株为LBA4404或EHA105，质粒为PCAMBIA1301，筛选标记为除草剂(bar)。2.农杆菌的培养及转化液的制备农农杆菌株转化液的制备包括三个过程增殖培养、病毒基因诱导培养、转化液的配置。具体的操作过程如下1、从-70°C冻存的农杆菌株LBA4404-1301-bar刮取少量菌体，接种于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP平板上，于避光培养2d ；2、从YEP平板上挑取单菌落接种于含上述抗生素的YEP液体培养基中J8°C， 230rpm 培养 16_24h ；3、吸取上述过夜培养物按1 50的比例接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中扩大培养，280C 230rpm振荡培养4_6h，至0D600值为0. 6-0. 8 ；4、经增殖培养的农杆菌菌液离心后收集菌体，按照离心前菌液体积1 50的比例，用AB诱导液悬浮菌体，然后于条件下150-180rpm震荡培养12h，进行农杆菌的Vir 基因诱导培养；所述的AB诱导培养液含3g/L K2HP04、lg/L NaH2P04、lg/L NH4C1、0. 3g/ L MgS04 · 7H20、0. 15g/L KC1、0. Olg/L CaC12、0. 0025g/L FeS04 · 7H20、0. 5g/L MES、2mM Na3P04、5g/L蔗糖、5g/L葡萄糖、IOOuM乙酰丁香酮，pH为5. 6。5、经病毒基因诱导培养后的农杆菌菌液离心后，用MS转化液重新悬浮菌体，转化液0D600值调整为0. 8-1. 0，此菌液即为农杆菌转化液；其中，MS转化液为组分为1/4MS、 2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2，4_D、100uM 乙酰丁香酮，pH 为 5. 8。
3.农杆菌转化液的注射从试验田中选取生长健壮的玉米植株，在玉米雌穗抽丝前用纸袋将其套住，当花丝抽出雌穗苞叶4-5cm时，开始注射。首先将农杆菌转化液，添加0.03%-0.05% (V/V)浓度的表面活性剂Silwet L-77后，装入电动注射仪中，然后从雌穗下部将注射仪针头插入雌穗最内层苞叶处，按住压力开关3-5秒，然后将针头拔出，注射完毕。一次后重复一次注射。 然后用剪刀将花丝贴近苞叶处剪平，注射后24h后开始授粉。上述电动注射仪如图1所示， 包括转化液容器1、压力电泵2、压力控制阀3、塑料软管4、注射控制阀5、注射针头6 ；压力电泵2位于转化液容器1底部并和塑料软管4相连；压力电泵2在压力控制阀3的控制下， 将转化液容器1中的转化液压入塑料软管4 ；塑料软管4 一端连接压力电泵2，另一端通过注射控制阀5连接注射针头6 ；注射控制阀5为按压式，按压打开注射控制阀5，放开关闭注射控制阀5 ；打开注射控制阀5时，被压力电泵2压入塑料软管4中的转化液通过注射针6 注射。压力电泵2由内置的电池组驱动。4.转化体的筛选待植株种子成熟后收获T1代种子，脱粒并晒干，然后播种。待幼苗长至2-3叶期， 开始进行除草剂抗性筛选。除草剂(Basta)要均勻的喷洒到每一颗幼苗的叶片上，浓度为 0.1%。一周后观察哪些幼苗是具有抗性植株。5.转化体的PCR的检测对除草剂筛选表现抗性的玉米植株，分别挂牌编号，将其叶片取回，采用CTAB法提取叶片基因组。根据载体中bar基因序列设计特异性引物，引物序列如下Bar-F 5' GCCTCGAGATGAGCCCAGAACGACG 3‘Bar-R 5' GCCTCGAGTCAGATCTCGGTGACGG 3‘以抗性植株的DNA为模板进行PCR检测(L1-L5)，含bar基因的质粒为阳性对照 ⑴，以未转化玉米植株叶片DNA为阴性对照㈠，反应条件如下
94 "C 94 "C 65 "C 72 "C 72 "C反应体系如下10XPCR buffer :5μ LdNTP (IOmM) 1 μ LBar-F(IOuM) :2 μ LBar-R(IOuM) :2 μ LDNA模板0· 6μ LTaq 酶0· 4μ LddH20 补足 50 μ LPCR扩增后的产物在含有0. 5 μ g/mL溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB)的1. 0%
5 min 45 sec 30 sec 30 sec IOmin
32 cycles琼脂糖凝胶上电泳，产物大小为^Obp。结果显示选取的5株抗性玉米植株PCR检测均为阳性，如图2所示。通过除草剂抗性筛选和PCR分子检测，表明外源基因已经成功地整合到玉米基因组中，整个流程操作简单，转化频率高，为玉米转基因技术提供了一种简便、高效的新方法。
权利要求
1.一种高通量农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，农杆菌菌株为 LBA4404或EHA105，质粒为PCAMBIA1301，筛选标记为除草剂，包括以下步骤步骤1 对农杆菌进行增殖培养，病毒基因诱导培养后，配制农杆菌转化液；步骤2 将步骤1的农杆菌转化液注入玉米雌穗最内层苞叶的空隙处，浸泡雌花序一定时间后进行授粉；步骤3 收获种子播种后，对幼苗进行除草剂抗性筛选；步骤4 对具有除草剂抗性的植株进行PCR检测筛选。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，所述的步骤1的增殖培养方法为将冻存的农杆菌株接种于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEP平板上，于观！避光培养2d后，从YEP平板上挑取单菌落接种于含上述抗生素的 YEP液体培养基中，28 V，230 rpm培养16-24 h ；吸取上述过夜培养物按1 50的比例接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中扩大培养，28 0C 230 rpm振荡培养4-6 h，至0D_ 值为 0. 6-0.8。
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，所述步骤1的诱导培养方法为经增殖培养的农杆菌菌液离心后收集菌体，按照离心前菌液体积 1 50的比例，用AB诱导液悬浮菌体，然后于条件下150-180rpm震荡培养12h，进行农杆菌的Vir基因诱导培养；所述的AB诱导培养液含3g/L K2HP04、lg/L NaH2P04Ug/L NH4Cl、0.3g/L MgS04*7 Η20、0· 15g/L KCl、0· Olg/L CaC12、0. 0025g/L FeS04*7H20、0. 5g/ L MES、2 mM Na3P04、5g/L 蔗糖、5g/L 葡萄糖、100 uM 乙酰丁香酮，pH 为 5. 6。
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，所述步骤1的配制农杆菌转化液为将经诱导培养后的农杆菌菌液离心后，用MS转化液重新悬浮菌体，转化液OD6tltl值调整为0. 8-1. 0，此菌液即为农杆菌转化液；所述MS转化液为组分为 1/4MS、2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2，4_D、100uM 乙酰丁香酮，pH 为 5. 8。
5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，所述步骤2的农杆菌转化液在注入玉米雌穗最内层苞叶的空隙之前，添加0. 03% - 0. 05%表面活性剂 Silwet L-77。
6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，农杆菌转化液注入玉米雌穗使用电动注射仪；所述电动注射仪包括转化液容器(1)、压力电泵 (2)、压力控制阀(3)、塑料软管(4)、注射控制阀(5)、注射针头(6)；压力电泵(2)位于转化液容器⑴底部并和塑料软管⑷相连；压力电泵⑵在压力控制阀⑶的控制下，将转化液容器(1)中的转化液压入塑料软管；塑料软管(4) 一端连接压力电泵O)，另一端通过注射控制阀( 连接注射针头(6)；注射控制阀( 为按压式，按压打开注射控制阀(5)， 放开关闭注射控制阀(5)；打开注射控制阀(5)时，被压力电泵(2)压入塑料软管(4)中的转化液通过注射针(6)注射。
7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其特征在于，玉米雌穗在抽丝前用纸袋套住，于转化液注入24h后进行授粉。
全文摘要
本发明公开了一种高通量农杆菌介导的玉米基因原位转化方法，其主要步骤包括1、含有外源目的基因的农杆菌转化液的培养；2、转化液添加表面活性剂SilwetL-77后用电动注射仪将该转化液注入到玉米雌穗最内层苞叶的空隙处，使其浸泡雌花序，然后进行授粉；3、将收获种子播种后，对玉米幼苗除草剂抗性筛选，对除草剂抗性植株进行PCR检测，获得转基因植株。本方法避免了组织培养过程中对外植体基因型要求严格的缺陷和植株再生的过程，缩短了玉米转基因周期，利用电动注射仪每人每天可完成6000-8000株玉米的转化，可获得大量的转化体，进行玉米转基因研究。
文档编号A01H5/00GK102533851SQ20121002199
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者何红升, 周建, 朱苏文, 程备久, 赵阳, 项艳, 马庆 申请人:安徽农业大学