专利名称：一种防治草莓重茬病的生防制剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物制剂，具体是指一种适用于草莓重茬地块，既能有效防治草莓根部土传病害,又能降解土壤中自毒物质的生防制剂及其制备方法。
背景技术：
(一)草莓重茬病危害严重
草莓(/7Tagaria ananassa Duch)属于蔷薇科草莓属,具有生长周期短、管理方便、果实营养丰富的特性。据统计，2007年中国草莓总面积约8.6万hm2，总产量约150万t，栽培面积和总产量均居世界第首位。由于耕地数量的限制和生产上广泛采用设施栽培，草莓重茬现象十分普遍。重茬导致草莓生长发育不良、根部病害发生严重、产量和品质急剧下降的现象，被称为重茬病(或再植病害)。草莓重茬2年后，产量损失一般为10°/Γ15%，重茬3年减产20% 25%，重茬4年以上至少减产40%，严重者绝收。(二)重茬病发生原因复杂
重茬病是一种困扰农业可持续生产的复杂问题，据报道土壤真菌病害加重、自毒作用、线虫增多、作物对土壤营养元素片面吸收和土壤理化性状劣化等都是重茬病的主要原因。但其根本原因是土壤微生态环境恶化，连作使草莓根际微生物生态环境向有利于病原物群体数量增加、根系抗病性降低的方向转变，根系自毒物质的产生是导致这种转变的核心机制，此观点也为国内外研究学者所公认。围绕根系自毒物质对土壤微生态环境影响的研究也日益成为揭示重茬发生机理的热点。(三)重茬病防治现状分析
关于解决草莓重茬的问题 主要依靠农业措施、化学防治和生物防治。以前常用换地、客土、大水浸泡和太阳能高温消毒等方法解决草莓的重茬问题，但由于耕地数量、设施栽培和地理条件的影响，很多处理方法均受一定条件的限制，且防治效果较差。土壤熏蒸剂溴甲烷处理效果较好，但其威胁人、畜健康，破坏大气臭氧层，严重污染水和土壤，能使土壤中的有益微生物群落明显减少，因此由联合国环境署发起签订的《蒙特利尔议定书》已明确规定禁止使用溴甲烷。业内虽然已研究出溴甲烷的替代药剂如棉隆、氯化苦，但此药剂的长期使用，势必也会存在如其它农药产品(速克灵、甲基托布津、多菌灵、扑海因等)引发的环境污染、病原菌抗药性问题等。由于缺乏高效且环境友好型控制技术和产品，重茬问题已严重影响了草莓生产可持续发展。鉴于生物防治防效较长、不污染环境、安全性较高和不易产生抗性的优点，现已逐渐成为作物重茬病防治研究的热点。自20世纪60年代以来，土壤改良剂和有机添加剂的研究屡见报道。良好的土壤改良剂或辅以拮抗微生物的有机添加剂不仅能改善土壤理化性状、促进植物生长发育、提高产量和品质，而且对很难用药剂防治的土传病害也有较好的控制作用。在诸多改良剂研究中，大多以植物材料(绿肥植物、植物秸杆和残体等)作主体。微生物的生命代谢活动能减少土壤环境中有毒有害物的浓度或抑制病菌的生长繁殖，使受破坏的土壤逐渐向健康状态恢复，例如有些木霉、假单胞菌和芽孢杆菌等对多种土传病原害均具有较好的防治效果。目前虽然大量具有生防潜力的微生物被研究报道，但大部分均是在室内模拟研究其防治效果，只有极少数的生防菌株用于商业化制剂生产，这是因为生防菌株以活体形式施入土壤后，会受到多种不利环境因素的影响，自身在土壤中难以存活或形成优势菌群，故使生物防治的应用受到巨大的限制。随着连作年限的延长，土壤中草莓根系分泌或腐解产生的自毒物质和病原菌数量会逐年积累，连作障碍也会越来越严重。因此，利用安全、高效、环境友好型的生物防治措施势必会成为改善当前草莓连作种植现状的最佳选择。筛选降解能力强、在草莓根际定殖能力强的菌株是未来开发防治作物重茬病生防制剂的主攻方向，同时施用对植物病原菌表现强抑制作用的植物提取物或药用植物材料，并辅以质优价廉的发酵基质制成生防制剂。这样既能为降解菌提供优质载体，施入土壤后能降解自毒物质，又能抑制土传病原菌的增殖，将会有很高的开发价值和很好的开发前景。
发明内容
本发明是针对草 莓重茬病日益严峻的现状，筛选出对草莓根系主要自毒物质对羟基苯甲酸和苯甲酸具有较强降解作用的菌株和对草莓土传病原菌具有较强抑制作用药用植物材料。以资源广泛且廉价的有机材料为基质，以适量的药用植物材料作为抑菌物质，确定了解酚菌株的高效固态发酵工艺，研制成一种既能有效防治草莓土传病害，又能降解根际土壤中自毒物质的生防治剂。通过日光温室小区和温室大棚试验测定生防治剂对草莓根部病害的防治效果和对自毒物质的降解能力，确定生防制剂在田间的使用方法。最终达到通过施用生防制剂降低土壤中草莓根系自毒物质的含量、抑制土传病害的发生、改善土壤理化特性和提高草莓经济产量的多重效果。迄今为止，尚未发现有关利用抑菌药用植物材料和自毒物质降解菌制成生防制剂防治草莓重茬病的报道，本发明的发明人通过深入研究和实践，研究开发了防治草莓重茬病的生防制剂，从而完成了本发明。本发明的目的是提供一种适用于草莓重茬地块，既能有效防治草莓土传病害，又能降解土壤中根系自毒物质的生防制剂。本发明的另一个目的是提供该生防制剂的制备方法。本发明的发明人从土壤中筛选到一株能同时降解草莓自毒物质对羟基苯甲酸和苯甲酸的菌株B259，室内测定48 h内对两种自毒物质的降解率分别高达94. 6%和88. 7%。再分别以无菌苦参、枳实、山柰、百部、苦枳(苦参与枳实等重量比)和山百(山柰与百部等重量比)为基质，接种降解菌B259发酵后，其上清液对草莓根系主要三种土传病原菌抑制作用最大的是山柰与百部混合物。采用三因素三水平正交设计，室内测得降解菌B259的最佳发酵条件为玉米秸杆粉、麦麸和山百混合发酵材料的各组分比例为20 15 :3，最高活菌菌落个数能达2.1XlO9个/g。经菌落形态、革兰氏和芽孢染色等形态学鉴定及16SrDNA序列分子鉴定，菌株B259为烟酸芽孢杆菌(feci77心niacin1、。该菌株已与2012年I月17日送至中国科学院微生物研究所(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保存，保存编号为CGMCC No. 5738。本发明的发明人综合考虑发酵培养基各成分成本，同时参考相关文献和传统固体发酵培养基配方，经大量试验证明得B259最佳固体发酵培养基配方如下1、以玉米秸杆粉、麦麸、山百为固体原料，各组分最优用量(质量)为玉米秸杆粉20份、麦麸15份、山百3份；2、固体发酵培养基接种条件B259接种量为10% (体积重量)，28°C，初始含水量为50%，pH值为7. O，接种后培养时间为72 98h。本发明生防制剂的生产工艺流程见说明书附图
。本发明的主要特点是本生防制剂非常适应草莓常年重茬地块，施入重茬土壤后，在快速降解土壤中的自毒物质的同时，能抑制土壤中病原菌对作物的侵染，同时还能提高草莓植株长势和抗病性，增加草莓的产量和质量。此外，使用本发明产品还有利于优化草莓重茬土壤的理化性状，不污染环境，对人畜安全，成本低，施用方便。本发明中生防制剂对草莓土传病害的控制效果及自毒物质的降解作用，通过以下试验加以说明。实验例1:
本发明的生防制剂防治草莓重茬病小区试验 试验品种丰香草莓
试验地点河北农业大学气象站日光温室 试验设计1、小区设置
试验于2009 2010年进行，每小区面积为8m2，小区之间用深埋IOOcm的水泥板隔开。2、生防制剂的防效测定
选取具备5片功能叶、大小均匀的种苗于8月8日定植，平畦栽培，每小区种5行，行距20cm，株距15cm。定植前将本发明的生防制剂以10g/m2的量均匀翻埋至耕层土壤，试验设接种尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌和对照4个处理，随机区组排列，每处理4次重复。分别于定植期、始花期、盛 花期和结果期分别在每小区5点取样，每点3株，调查草莓各生长发育指标和小区产量。根据根系发病情况，计算病情指数和相对防效。3、自毒物质降解率测定
在草莓始花期、盛花期和结果期分别采用5点取样法，用土钻从5-20cm的根围土层取土，风干后研磨过40目筛，各处理土样50g，分别按体积比为1:3加入95%乙醇提取，旋转蒸发浓缩后定容至10mL。用HPLC法测定对羟基苯甲酸和苯甲酸的含量(见表4)。试验结果
本发明生防制剂处理接种不同病原菌的草莓后，可明显提高草莓植株的各项生长发育指标(见表1)，如根长、根数、根干重、地上部干重和叶面积数量；其中，生防制剂处理尖孢镰刀菌后，其指标提高幅度最大。生防制剂处理后草莓的单株果实数、最大果重和产量也明显得到提高(见表2)。表I生防制剂对草莓生长发育状况的影响
权利要求
1.一种在草莓重茬地块使用，既能有效防治草莓土传病害，又能降解土壤中草莓根系自毒物质的生防制剂及其制备方法，其特征在于包括菌株B259和菌株B259的固体发酵培养基配方和固体发酵工艺，该菌株是烟酸芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 5738。
2.权利要求1所述生防制剂，其特征在于所用最优固体发酵培养基配方如下玉米秸杆粉、麦鉄、中药材山奈沿1n'a gaIangaI L.)与百部(5 6 ο/7<3 sessilifolia、等重量混合物，按重量比20 15 :3混匀后为固体原料，每公斤固体原料中加入营养液500 mL,营养液配方为葡萄糖 8g、MgS04lg、CaCL22g、(NH4) 2S0410g、蒸懼水 1000mL。
3.权利要求1所述固体发酵工艺特点，其特征在于将麦麸、玉米秸杆粉、山柰与百部等重量混合物混合后，再加入营养液搅拌均匀；装袋后高温灭菌(121°C灭菌60min)，制成无菌固体培养料；B259接种条件为以10%的接种量(容积重量)；最适温度28°C、初始含水量50%、初始pH 7. 0，培养时间为72h ;固体培养料接种后送入培养室，28°C下培养，经检验每克固体培养料中菌株B259数量达到2X IO8个的菌剂质量标准后，包装标记得本发明生防制剂成品。
4.根据权利要求1所述生防制剂防治草莓重茬地块草莓枯萎病、草莓黄萎病和草莓立枯病，以及缓解自毒物质毒害的应用。
全文摘要
本发明公开了一种适用于草莓重茬地块，既能防治草莓土传病害，又能降解自毒物质的生防制剂及其制备方法。目前，由于土地资源及栽培方式等因素的限制，致使草莓重茬现象日趋严重，明显降低了草莓的产量和品质。本发明以山百混合物(山柰与百部等重量比)、玉米秸秆粉、麦麸为固体原料，以解酚菌为生防菌制成生防制剂很适合用于草莓重茬地块，该制剂施入重茬地块后，能明显减轻土传病害的发病程度，降低土壤中强自毒物质对羟基苯甲酸和苯甲酸的含量，促进草莓生长指标的发育，最终能显著提高草莓产量。本发明产品主要适用于草莓枯萎病、菌核病和黄萎病等土传病害的防治，有利于优化草莓重茬土壤的理化性状，不污染环境，对人畜安全，成本低，施用方便。
文档编号A01P3/00GK103053621SQ20121002168
公开日2013年4月24日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者甄文超, 齐永志, 尹宝重, 代丽, 扈金丽 申请人:河北农业大学