抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物菌剂的制作，特别是指抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺。是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源及氮源的发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉。本发明解决了现有技术存在的肥力降低，有毒物质积累，严重影响草莓的品质和产量问题，具有抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的各项技术指标符合GB20287-2006的要求，保质期达18个月以上，比采用氯化苦熏蒸的大棚中的草莓在产量、糖酸比、可溶性固形物含量、Vc含量等技术指标上具备明显优势，能很好的降低发病率，增强作物抗性，提高草莓产量等优点。
【专利说明】抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物菌剂的制作，特别是指抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺。
【背景技术】
[0002]草莓重茬病一直是困扰草莓生产的重要问题，尤其是随着设施产业的不断扩大，这个问题越来越突出。目前草莓要连续种植普遍采用的方法就是剧毒农药溴甲烷土壤熏蒸法。但该药的使用成本高达每公顷一万五千元以上，且药效仅管当年，另外溴甲烷是剧毒气体，对大气臭氧层破坏严重，在2005年联合国环保组织已将其列为限用药物。大量有毒药剂的使用使土壤的理化性质进一步恶化，肥力降低，有毒物质积累，严重影响草莓的品质和产量。国内外的研究表明，造成作物重茬的主要原因是土壤营养元素的缺乏和土传病害所致。土传病害，同一作物的耕作、施肥、灌溉等方式固定不变，连年耕作，使土壤环境恶化，肥力降低，有毒物质积累，有益微生物菌群数量减少，引发病原微生物的大量滋生。草莓重茬病的生物防治对环境保护和提高草莓国际市场竞争力具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种抗草莓重巷用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺。
[0004]本发明的整体技术构思是:
[0005]抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成:
[0006]豆柏2.0% -3.0% ;玉米浆干粉0.5% -1.5 % ;淀粉0.5% -1.5 % ;葡萄糖0.4% -0.6% ;浓度为 30.8mg/L 的 MnSO4 溶液 0.1% -0.3% ；NaC10.05% -0.15% ;消泡剂
0.05%。-0.15%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0007]通气发酵的工艺条件如下:
[0008]搅拌转速为150-250rpm,0-4 小时:通风量为 1:0.9-1.lvvm，温度为 32°C -36°C ；4-8小时:通风量为1:L0-L2vvm，温度为33°C _37°C;8小时后:通风量为1:1.1-1.3vvm,温度为34°C -38°C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
[0009]本发明中的芽孢率检测采用平板计数，培养基采用营养琼脂，计数方法参照GB20287-2006。
[0010]本发明中的具体技术内容还有:
[0011] 为便于菌种有效利用发酵培养基中的营养物质，优选的技术方案是，所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理:
[0012]在酶解罐内加入豆柏200kg-250kg及水1200L-1600L，加温至33°C _37°C，加入中性蛋白酶 0.9kg-l.2kg，在 IOOrpm 搅拌 2.0-2.5h。[0013]为缩短发酵周期，常见的技术方案是，所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发
酵培养基前经过扩大培养。
[0014]其中更为优选的技术方案是，所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
[0015]所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤:
[0016]将菌种转接到试管斜面培养基上，在温度为30°C -35°C培养36h_48h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，30°C -35°C培养36h-48h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，30°C -35°C培养48h-72h ；
[0017]其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏1% -5%，蛋白胨3% -8%，氯化钠3% -8%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为70mL。
[0018]所述的种子液的制备包括如下工艺步骤:
[0019]用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35°C _45°C时接种，压力为0.03-0.05MPa，搅拌转速为150_250rpm，0_4小时:通风量为1:0.7-0.9vvm，温度为33°C-37°C;4-8小时:通风量为1:0.8-l.0vvm，温度为330C -370C ；8小时后:通风 量为1:0.9-1.lvvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
[0020]所述的发酵液加热至35_45°C，加入质量百分含量为3.0% -4.0%的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为3.0% -4.0%的氯化钙，50-100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
[0021]更为优选的技术方案是，所述的菌粉中的含菌数为2X IOltlCfu/克。
[0022]本发明中所涉及的各项数据的获得采用如下方法:
[0023]1、发酵液计数:称取样品10mL，加入带玻璃珠的IOOmL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液菌悬液(基础液)。
[0024]用无菌移液管分别吸取5.0mL上述母液菌悬液加入45ml无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1 X IO1,1:1 X IO2,1:1 X IO3,1:1 X IO4……稀释的菌悬液(每个稀释
度应更换无菌移液管)。
[0025]2、加样及培养:每个样品取3个连续适宜的稀释度，用无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1ml，加至预先制备好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
[0026]每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于适宜的条件下培养。
[0027]3、菌落识别:根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。菌落计数以出现20-300个菌落数的稀释度的平板为计数标准(丝状真菌为10-150个菌落数)，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度，其平均菌落数在20-300个之间时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20-300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。
[0028]4、有效活菌数按式⑴或式⑵计算:
[0029]Ω= kvj (/? K2) X I O—8.....................( I )[0030]η= χ kvj (V0 ν2) X I O—8.....................( 2 )
[0031]式中:
[0032]nm一质量有效活菌数,亿/g
[0033]nv—体积有效活菌数，亿/mL
[0034]I一菌落平均数(个)
[0035]k一稀释倍数
[0036]V1一基础液体积(mL)
[0037]v2—菌悬液加入量(mL)[0038]Vtl—样品量(mL)
[0039]IHci—样品量(g)。
[0040]5、发酵液处理:
[0041]发酵液在75 °C -85 °C水浴处理15_20min，杀死几乎所有菌体后，芽孢计数，计数方法同发酵液计数方法。
[0042]芽孢率=热处理后的芽孢数/发酵液的菌数X %。
[0043]本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于:
[0044]1、 申请人:对利用本发明的方法制备的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂进行检测，各项技术指标符合GB20287-2006的要求，保质期达18个月以上。
[0045]2、经 申请人:在保定市满城县草莓大棚中进行的对比试验结果表明，使用本发明制备的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂比采用氯化苦熏蒸的大棚中的草莓在产量、糖酸比、可溶性固形物含量、Vc含量等技术指标上具备明显优势，能很好的降低发病率，增强作物抗
性，提高草莓产量。
【具体实施方式】
[0046]以下结合实施例对本发明作进一步及描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
[0047]实施例1
[0048]抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成:
[0049]豆柏2.0% ;玉米浆干粉0.5% ;淀粉0.5% ;葡萄糖0.4% ;浓度为30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.1% ；NaC10.05% ;消泡剂 0.05% ;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH 值 7.0±0.I ；
[0050]通气发酵的工艺条件如下:
[0051]搅拌转速为150rpm，0-4小时:通风量为1:0.9vvm，温度为32°C -36°C ;4_8小时:通风量为1:1.0vvm，温度为33°C -37°C；8小时后:通风量为1:1.lvvm，温度为34°C -38°C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
[0052]所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理:[0053]在酶解罐内加入豆柏200kg及水1200L，加温至33°C -37°C，加入中性蛋白酶
0.9kg,在 IOOrpm 揽拌 2.0h。
[0054]所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发酵培养基前经过扩大培养，所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
[0055]所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤:
[0056]将菌种转接到试管斜面培养基上，在温度为30°C培养48h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，30°C培养48h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，30°C培养72h ；
[0057]其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏1%，蛋白胨3%，氯化钠3%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为 70mL。
[0058]所述的种子液的制备包括如下工艺步骤:
[0059]用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35°C时接种，压力为0.03MPa，搅拌转速为150rpm，0_4小时:通风量为1:0.7vvm，温度为330C -37°C;4_8小时:通风量为I:0.8vvm，温度为33°C -37°C；8小时后:通风量为1:0.9vvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
[0060]所述的发酵液加热至35°C，加入质量百分含量为3.0%的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为3.0-4.0%的氯化钙，50_100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
[0061]所述的菌粉中的含菌数为2 X IOltlCfu/克。
[0062] 实施例2
[0063]抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成:
[0064]豆柏3.0% ;玉米浆干粉1.5% ;淀粉1.5% ;葡萄糖0.6% ;浓度为30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.3% ；NaC10.15% ;消泡剂 0.15% ;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0065]通气发酵的工艺条件如下:
[0066]搅拌转速为250rpm，0-4小时:通风量为1:1.lvvm，温度为32°C -36°C ;4_8小时:通风量为1:1.2vvm，温度为33°C -37°C；8小时后:通风量为1:1.3vvm，温度为34°C -38°C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
[0067]所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理:
[0068]在酶解罐内加入豆柏250kg及水1600L，加温至33 °C -37 °C，加入中性蛋白酶
1.2kg,在 IOOrpm 揽拌 2.5h。
[0069]所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发酵培养基前经过扩大培养，所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
[0070]所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤:
[0071]将菌种转接到试管斜面培养基上，在温度为35°C培养36h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，35°C培养36h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，35 °C培养48h ；
[0072]其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏5%，蛋白胨8%，氯化钠8%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为 70mL。
[0073]所述的种子液的制备包括如下工艺步骤:
[0074]用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35-45°C时接种，压力为0.03-0.05MPa，搅拌转速为250rpm，0_4小时:通风量为1:0.9vvm，温度为330C -37°C ;4_8小时:通风量为I:1.0vvm，温度为33°C -37°C ；8小时后:通风量为1:1.lvvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
[0075]所述的发酵液加热至35_45°C，加入质量百分含量为4.0 %的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为4.0%的氯化钙，50-100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
[0076]所述的菌粉中的含菌数为2 X IOltlCfu/克。
[0077]实施例3
[0078]抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成:
[0079]豆柏2.5% ;玉米浆干粉0.8% ;淀粉1% ;葡萄糖0.5% ;浓度为30.8mg/L的MnSO4溶液 0.2% ；NaC10.1% ;消泡剂 0.1%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0080]通气发酵的工艺条件如下:
[0081]搅拌转速为150-250rpm，0-4小时:通风量为l:lvvm，温度为32 °C -36 °C ;4_8小时:通风量为1:1.lvvm，温度为33 °C -37 °C ；8小时后:通风量为l:1.2VVm，温度为340C -380C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
[0082]所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理:
[0083]在酶解罐内加入豆柏220kg及水1500L，加温至33°C _37°C，加入中性蛋白酶1kg，在 IOOrpm 搅拌 2.0-2.5h。
[0084]所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发酵培养基前经过扩大培养，所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
[0085]所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤:
[0086]将菌种转接到试管斜面培养基上，在温度为32°C培养40h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，32°C培养40h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，32 °C培养60h ；
[0087]其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏3%，蛋白胨5%，氯化钠5%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为 70mL。
[0088]所述的种子液的制备包括如下工艺步骤:
[0089]用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35-45°C时接种，压力为0.04MPa，搅拌转速为150_250rpm，0_4小时:通风量为1:0.8vvm,温度为33°C -37°C ;4_8小时:通风量为1:0.9vvm，温度为33°C -37°C ；8小时后:通风量为l:lvvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
[0090]所述的发酵液加热至35_45°C，加入质量百分含量为3.5%的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为3.5%的氯化钙，50-100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
[0091]所述的菌粉中的含菌数为2 X IOltlCfu/克。
[0092]实施例4
[0093]抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成:
[0094]豆柏2.2% ;玉米浆干粉0.7% ;淀粉0.7% ;葡萄糖0.45% ;浓度为30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.15% ；NaC10.08%;消泡剂 0.08%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0095]通气发 酵的工艺条件如下:
[0096]搅拌转速为150-250rpm，0-4小时:通风量为l:lvvm，温度为32 °C -36°C ;4_8小时:通风量为1:1.0-1.2vvm，温度为33°c-37°c;8小时后:通风量为1:1.1-1.3vvm，温度为340C -380C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
[0097]所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理:
[0098]在酶解罐内加入豆柏240kg及水1300L，加温至33°C _37°C，加入中性蛋白酶1kg，在 IOOrpm 搅拌 2.1h。
[0099]所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发酵培养基前经过扩大培养，所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
[0100]所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤:
[0101]将菌种转接到试管斜面培养基上，在温度为30°C -35°c培养38h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，30°C -35°C培养38h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，30°C -35°C培养60h ；
[0102]其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏2%，蛋白胨4%，氯化钠4%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为 70mL。
[0103]所述的种子液的制备包括如下工艺步骤:
[0104]用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35-45°C时接种，压力为0.04MPa，搅拌转速为150_250rpm，0_4小时:通风量为 1:0.75vvm，温度为 330C -37°C ;4_8 小时:通风量为 1:0.85vvm，温度为 33°C -37°C ；8小时后:通风量为l:lvvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
[0105]所述的发酵液加热至35_45°C，加入质量百分含量为3.5%的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为3.5%的氯化钙，50-100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
[0106]所述的菌粉中的含菌数为2X IOltlCfu/克。
[0107]实施例5[0108]抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；发酵培养基由如下质量百分数的组分组成:
[0109]豆柏2.8% ;玉米浆干粉1.2% ;淀粉1.2% ;葡萄糖0.55% ;浓度为30.8mg/L的MnSO4 溶液 0.25% ；NaC10.13%;消泡剂 0.13%。;消前 pH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ；
[0110]通气发酵的工艺条件如下:
[0111]搅拌转速为150-250rpm，0-4小时:通风量为1:1.1vvm,温度为32 °C -36 °C ；4-8小时:通风量为1:1.2vvm，温度为33°C -37°C ；8小时后:通风量为1:1.3vvm，温度为340C -380C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
[0112]所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理:
[0113]在酶解罐内加入豆柏240kg及水1500L，加温至33°C -37°C，加入中性蛋白酶
1.1kg,在 IOOrpm 搅拌 2.4h。
[0114]所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发酵培养基前经过扩大培养，所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
[0115]所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤:
[0116]将菌种转接到试管 斜面培养基上，在温度为30°C -35°C培养45h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，30°C -35°C培养45h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，30°C -35°C培养65h ；
[0117]其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏4%，蛋白胨7%，氯化钠7%，pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为 70mL。
[0118]所述的种子液的制备包括如下工艺步骤:
[0119]用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35-45°C时接种，压力为0.04MPa，搅拌转速为220rpm，0_4小时:通风量为1:0.85vvm，温度为 330C -37°C ;4_8 小时:通风量为 I:0.9vvm，温度为 33°C -37°C ；8 小时后:通风量为l:lvvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
[0120]所述的发酵液加热至35_45°C，加入质量百分含量为3.8%的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为3.8%的氯化钙，50-100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
[0121]所述的菌粉中的含菌数为2 X IOltlCfu/克。
[0122] 申请人:对实施例1-5中制备的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂进行如下试验，试验于保定市满城县农户家草莓大棚内进行。选取条件一致的草莓大棚6个,5个大棚施用抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂，一个大棚采用氯化苦熏蒸。菌剂连续两年使用，每年分别调查草莓的发病率，产量和果实品质。试验结果如表1。
[0123]表1连续两年施用抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的草莓各项指标的变化
[0124]
【权利要求】
1.抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，是将地衣芽胞杆菌ACCC01957接种于含有碳源、氮源、无机盐及微量元素的发酵培养基进行通气发酵制成发酵液，发酵液经絮凝、添加保护剂，载体吸附，喷雾干燥喷干制成菌粉；其特征在于发酵培养基由如下质量百分数的组分组成: 豆柏 2.0% -3.0%;玉米浆干粉0.5% -1.5%;淀粉0.5% -1.5%;葡萄糖0.4% -0.6%；浓度为 30.8mg/L 的 MnSO4 溶液 0.1% -0.3%；NaC10.05% -0.15%;消泡剂 0.05%。-0.15%；消前 PH = 7.6±0.I 消后 pH = 7.0±0.I ； 通气发酵的工艺条件如下: 搅拌转速为150-250rpm，0-4小时:通风量为1:0.9-1.lvvm，温度为32°C _36°C;4_8小时:通风量为1:1.0-1.2VVm，温度为33°C-37°C;8小时后:通风量为1:1.l-1.3VVm，温度为340C -380C，当芽孢率为90%以上时，作为发酵终点。
2.根据权利要求1所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的发酵培养基中的豆柏采用如下方法预处理: 在酶解罐内加入豆柏200kg-250kg及水1200L-1600L，加温至33°C _37°C，加入中性蛋白酶 0.9kg-l.2kg，在 IOOrpm 搅拌 2.0-2.5h。
3.根据权利要求1所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的地衣芽胞杆菌ACCC01957在接入发酵培养基前经过扩大培养。
4.根据权利要求3所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的扩大培养包括克氏瓶种子的制备以及种子液的制备。
5.根据权利要求4所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的克氏瓶种子的制备包括如下工艺步骤: 将菌种转接到试管斜面培养基上，在温度为30°C -35°C培养36h-48h，培养好的试管斜面再转接一次试管斜面培养基，30°C -35°C培养36h-48h，第二次培养好的试管斜面转接到克氏瓶斜面培养基上，30°C -35°C培养48h-72h ； 其中试管斜面培养基及克氏瓶培养基由如下质量百分含量的组分组成:牛肉膏1% -5%，蛋白胨3% -8%，氯化钠3% -8%,pH = 6.8-7.5 ;克氏瓶的容积为250mL，克氏瓶培养基的装量为70mL。
6.根据权利要求5所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的种子液的制备包括如下工艺步骤: 用无菌水清洗下两个克氏瓶斜面培养基上生长好的菌种至接种瓶中，待灭菌后的种子培养基温度35 °C -45 °C时接种，压力为0.03-0.05MPa，搅拌转速为150_250rpm，0-4小时:通风量为1:0.7-0.9vvm，温度为33°C -37°C ;4_8小时:通风量为1:0.8-l.0vvm，温度为330C -370C ；8小时后:通风量为1:0.9-1.lvvm，温度为30°C -35°C，发酵周期为12小时。
7.根据权利要求1所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的发酵液加热至35°C _45°C，加入质量百分含量为3.0% -4.0 %的磷酸二氢钠作为保护剂，50-100rpm转速搅拌I小时，加入质量百分含量为3.0% -4.0%的氯化钙，50_100rpm转速搅拌I小时，絮凝菌体，添加载体轻质碳酸钙后经喷雾干燥制成菌粉。
8.根据权利要求1或7中任一项所述的抗草莓重茬用地衣芽孢杆菌菌剂的生产工艺，其特征在于所述的菌粉中的含菌数为2X IOltlCfu/克。
【文档编号】A01P21/00GK103947682SQ201410209865
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】李宾, 马清河, 秦艳梅, 陈文杰, 罗同阳, 高庆华, 郑翔, 赵从波, 王云鹏, 章淑燕 申请人:河北省微生物研究所