一种生物复配杀菌组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物复配杀菌组合物，所述生物复配杀菌组合物含有5～40％吡唑醚菌酯和40~2000亿CFU/g的枯草芽孢杆菌两种活性组分。本发明还公开了上述生物复配杀菌组合物在防治草莓枯萎病中的应用。本发明复配药剂中枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯分别为不同作用机理的杀菌剂；该制剂对草莓重茬病害不但防治效果好，而且促进生长作用明显，对环境友好且具有成本低和加工简易的优点，明显减少病苗和死苗发生，明显提高重茬草莓种植产量和品质，能较好满足生产上农作物病害防治的需要。
【专利说明】-种生物复配杀菌组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农药【技术领域】，涉及一种生物复配杀菌组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 草莓（Fragaria ananassa Duch)以其果实柔软多汁、味道鲜美、营养丰富、生育期 短、结果早和产量高等特点备受欢迎，在国际市场上具有重要的经济地位。由尖孢镰刀菌草 莓专化型（Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)从根部侵染引起的草莓枯萎病，是危害 草莓的主要土传病害，由于大棚草莓连作现象很普遍，从而导致草莓枯萎病的发生越来越 严重，植株发病率可达89. 2%。草莓枯萎病主要发生在高温期，苗期或开花至收获期均可 发病。初期仅心叶变黄绿或黄色，有的卷缩或呈波状产生畸形叶，致病株叶片失去光泽，植 株生长衰弱，在3片小叶中往往有1?2片畸形或变狭小硬化，且多发生在一侧，老叶呈紫 红色萎蔫，被害株的根冠部、叶柄、果梗维管束都变成褐色至黑褐色，造成草莓生长发育迟 缓、匍匐茎明显减少，草莓结果减少、果实无法正常膨大，品质低，甚至全株枯死。
[0003] 目前对该病害仍以化学防治为主，常用恶霉灵、代森锰锌、多菌灵和甲基托布津 等杀菌剂根部施用，长期使用抗药性严重，且防效不尽理想，易造成农药残留超标和污 染环境。目前成功用于防治草莓枯萎病的生物农药专用制剂少。文献已报道生物防治 控制病害的生防菌属（种）主要有（1)木霉菌属真菌（Trichodermaspp.)中的绿色木 霉（Trichoderma viride)和哈茨木霉（Trichoderma harzianum) ; (2)芽抱杆菌属细 菌（Bacillus spp.)中的枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、多粘芽抱杆菌（Bacillus polymyxa)和巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium);⑶假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.)中的突光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens)等。由于单一生防菌往往防效不 够稳定等因素实际使用更少，因此，必须调整对草莓枯萎病的防治策略，合理使用杀菌剂， 同时也急需筛选出更多有效防治草莓枯萎病的杀菌剂。
[0004] 枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus subtilis)DJ-6菌株由镇江农科所从杜 娟根部分离筛选，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，保藏号为：CGMCC No. 6314,枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌 素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有 明显的抑制作用。吡唑醚菌酯又名唑菌胺酯，为新型广谱杀菌剂，其作用机理为线粒体呼吸 抑制剂，即通过在细胞色素合成中阻止电子转移，具有保护、治疗、叶片渗透传导作用，该化 合物低毒，对非靶标生物安全，而且对使用者和环境均安全友好，已被美国环保局列为"减 小风险的候选药剂"。
[0005] 采用枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯混配，弥补单一生防菌剂的不足，提高生物 农药的使用效果，也能减少化学防治。目前枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯的相关复配剂 没有报道，试验增效显著，对草莓枯萎病的效果明显好于单一制剂，能较好满足生产上农作 物作物病害防治的需要。
【发明内容】
[0006] 发明目的：本发明的第一个目的是提供了一种防治效果较好且高效低毒的生物复 配杀菌组合物。本发明的第二个目的是提供了上述杀菌组合物的应用。长期连作设施草莓 枯萎病等发生严重，生产中常用恶霉灵、多菌灵等化学农药根部施用，但草莓为不去果皮的 鲜食为主的水果，防止农药残留提高安全品质事关人们的健康，由于在草莓重茬病害上应 用的生物农药少，且因防效不够稳定等因素实际使用更少，为了提高生物农药的使用效果， 替代或减少化学防治，本发明通过对枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯混配科学组合防治 连作草莓田枯萎病等。
[0007] 技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种生物复配杀菌组合物，所述生 物复配杀菌组合物含有5?40%吡唑醚菌酯和40?2000亿CFU/g的枯草芽孢杆菌DJ-6 两种活性组分。
[0008] 其中，上述枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯重量比为1:1?1:5。
[0009] 其中，上述生物复配杀菌组合物为20 %吡唑醚菌酯· 200亿CFU/g枯草芽孢杆菌 DJ-6的可湿性粉剂。
[0010] 其中，上述生物复配杀菌组合物还包括助剂和填料。
[0011] 其中，上述杀菌组合物的剂型为可湿性粉剂、水乳剂、悬浮剂或水分散粒剂中的一 种。
[0012] 其中，上述助剂为表面活性剂和分散剂。
[0013] 其中，上述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，分散剂为NNO。
[0014] 其中，上述填料为白炭黑或高岭土中的一种或几种。
[0015] 上述的一种生物复配杀菌组合物在防治草莓枯萎病中的应用。
[0016] 在连作重茬的草莓田，草莓苗定植时将所述的杀菌组合物稀释1000-3000倍液， 每株灌根250ml。
[0017] 有益效果：本发明复配药剂中枯草芽孢杆菌DJ-6和吡唑醚菌酯分别为不同作用 机理的杀菌剂；该制剂对草莓重茬病害不但防治效果好，而且促进生长作用明显，对环境友 好且具有成本低和加工简易的优点，明显减少病苗和死苗发生，明显提高重茬草莓种植产 量和品质，能较好满足生产上农作物病害防治的需要。
【具体实施方式】
[0018] 供试原药（母药）：1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6 (BaciIlus subtiIi)母药， 由镇江农科所现代研究室提供；97%吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin)原药，由江苏耘农化工 有限公司提供。
[0019] 本发明的生物组合杀菌组合物可制成可湿性粉剂，将吡唑醚菌酯（折百重 量）20g，1000亿CFU/克枯草芽孢杆菌DJ-620g，十二烷基硫酸钠40g，扩散剂NN0460g，白炭 黑100g，高岭土余量，加至1000g，混合物进行气流粉碎，制得20%吡唑醚菌酯·200亿CFU/ g枯草芽孢杆菌DJ-6的可湿性粉剂。
[0020] 实施例1
[0021] 1、室内抑菌活性测定
[0022] I. 1试验时间与地点
[0023] 于2012年4一7月份在镇江市农业科学研究所现代农业研究室实验室进行。
[0024] L 2供试菌株
[0025] 草莓枯萎病菌，采自江苏省句容市大棚草莓，品种为红颊，由镇江市农业科学研究 所现代农业研究室分离、鉴定、及按照柯郝法则（Koch's Rule)验证后并保存备用。菌株保 存于马铃薯蔗糖琼脂（PSA)斜面上（4°C )。
[0026] 1. 3供试药剂
[0027] 1000亿CFU/克枯草芽孢杆菌DJ-6 (Bacillus subtiIi)母药，由镇江农科所现代 研究室提供；97%吡唑醚菌酯（(Pyraclostrobin)原药，由江苏耘农化工有限公司提供。
[0028] 1.4仪器设备
[0029] 电子天平（感量0. lmg)、GZP-300A培养箱、直径为75mm的培养皿、三角瓶、移液 器、移液管、洗耳球、打孔器、接种刀等。
[0030] 1. 5试验方法
[0031] I. 5. 1药液的配制及浓度设计
[0032] (1)母液配制：将1000亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6母药加无菌水配成10000 μ g/ mL，97%吡唑醚菌酯原药用适量丙酮溶解后并加入10%的吐温-80,配制成ΙΟΟΟμ g/mL母 液，置于4°C冰箱中备用。
[0033] (2)各药剂单剂与复配剂的浓度设计：枯草芽孢杆菌DJ-6、吡唑醚菌酯以及枯草 芽孢杆菌〇1-6与吡唑醚菌酯（1:1、1 :2、1:3、1:4和1:5)复配剂在含药？54中的浓度设计 均为 100. 00、50· 00、25· 00、12· 50、6· 25,3· 125, L 5625 和 0· 78125μ g/mL，8 个不同浓度梯 度的PSA培养基。除母液外，所有试验药剂系列浓度的药液均为现配现用。
[0034] 1. 5. 2试验方法
[0035] 采用菌丝生长速率法，将各单剂与复配剂的药液依次稀释至所需浓度，然后将ImL 药液与9mL培养基在培养皿内混匀，制成含系列浓度药剂的PSA培养基，采用无菌水作空白 对照，各处理重复4次。将保留的草莓枯萎病菌转接到PSA平皿中，在25°C下活化72h，然 后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5_的菌饼，并转接到含药的PSA平皿和空白对照中。 25 °C培养96h，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。
[0036] 计算菌落直径均值，并按照下列公式计算菌丝生长平均抑制率：
[0037] 菌丝生长平均抑制率={(对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）八对照菌落 直径均值-接种菌饼直径）} X 100 %，采用DPS13. 0专业版数据处理系统，计算出药剂对草 莓枯萎病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC5tl及其95 %置信限。
[0038] 根据Wadley法，计算增效系数（SR)。根据增效系数（SR)评价药剂混用的联合作 用类型，即SR〈0. 5为拮抗作用，0· 5彡SR彡L 5为相加作用，SR>1. 5为增效作用。
[0039] SR = EC50 (Eth) /EC50 (Eob)..........................................· · (1)
[0040] EC50 (th) = (a+b)/[(a/EC (A) 50+(b/EC (B)50].........................(2)
[0041] 其中，A、B分别为杀菌剂单剂，a、b为相应单剂在混剂中的比例，EC5tl (Eth)为混剂 EC5tl理论值，EC5tl(Eob)为混剂EC5tl实测值。
[0042] 1.6室内抑菌活性测定结果
[0043] 1. 6. 1枯草芽孢杆菌DJ-6及吡唑醚菌酯对草莓枯萎病菌菌丝生长的影响
[0044] 从表1中的结果表明，枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯的浓度为0.78125? 100 μ g/mL时，对草莓枯萎病病菌的抑菌率分别为3. 08?36. 92%、41. 03?77. 44%。
[0045] 表1枯草芽孢杆菌DJ-6与吡唑醚菌酯对草莓枯萎病菌的抑制效果（72h)
[0047] 注：菌落直径含菌饼5_。下同。
【权利要求】
1. 一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述生物复配杀菌组合物含有5?40 %吡 唑醚菌酯和4(Γ2000亿CFU/g的枯草芽孢杆菌DJ-6两种活性组分。
2. 根据权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌 DJ-6与吡唑醚菌酯重量比为1:1~1:5。
3. 根据权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述生物复配杀菌 组合物为20%吡唑醚菌酯· 200亿CFU/g枯草芽孢杆菌DJ-6的可湿性粉剂。
4. 根据权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述生物复配杀菌 组合物还包括助剂和填料。
5. 根据权利要求4所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述杀菌组合物的 剂型为可湿性粉剂、水乳剂、悬浮剂或水分散粒剂中的一种。
6. 根据权利要求4所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述助剂为表面活 性剂和分散剂。
7. 根据权利要求6所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述表面活性剂为 十二烷基硫酸钠，分散剂为NNO。
8. 根据权利要求4所述的一种生物复配杀菌组合物，其特征在于，所述填料为白炭黑 或高岭土中的一种或几种。
9. 权利要求1所述的一种生物复配杀菌组合物在防治草莓枯萎病中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在连作重茬的草莓田，草莓苗定植时将 所述的杀菌组合物稀释1000-3000倍液，每株灌根250ml。
【文档编号】A01P3/00GK104286031SQ201410487192
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】吉沐祥, 陈宏洲, 吴祥, 王莉莉, 缪康, 陈原, 朱成刚, 王健 申请人:江苏省绿盾植保农药实验有限公司, 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所