模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法，包括以下步骤：将农药杀菌剂配制成梯度浓度的试验药液；将生物藻原液用无菌水稀配制成藻稀释液；将试验药液与藻稀释液混合，密封条件下培养72h，每隔24h对藻细胞计数，并记录藻细胞的生物效应和试验液的理化参数；根据藻细胞的生物效应参数计算农药杀菌剂对藻细胞的半数效应浓度EC50，判断农药杀菌剂的毒性。本发明的方法具有易操作、实用性强、周期短，评价终点容易判断等优势。
【专利说明】
模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及养殖技术领域，尤其涉及一种模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方 法。
【背景技术】
[0002] 藻类作为水生生态系统的初级生产者，对水体的平衡和稳定起着极其重要的作 用。生物测试中的藻类测试是水生生态毒理学研究中必不可少的方法，农药在田间使用后 会迀移进入水体中，会对藻类的生长产生影响，从而影响整个生态系统。藻常被用于新化学 物质登记中的藻类生长抑制毒性试验研究和农药登记藻类生长抑制毒性试验研究。
[0003] 目前，国内外关于农药杀菌剂毒性筛选的研究报道较少，即使有部分报道和相关 研究性的模型，但是缺乏相关的研究数据评估该模型的适宜性和可靠性，并成为成熟和认 可的毒性筛选模型。因此，提供一种易操作、实用性强的藻类筛选农药杀菌剂毒性的方法尤 其重要。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种易操作、实用性强的 模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法。
[0005] 为解决上述技术问题，提供了一种模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法，包括 以下步骤：
[0006] Sl、将农药杀菌剂配制成梯度浓度的试验药液；
[0007] S2、将生物藻原液用无菌水稀配制成藻稀释液；
[0008] S3、将所述试验药液与所述藻稀释液混合，密封条件下培养72h，每隔24h对藻细胞 计数，并记录藻细胞的生物效应和试验液的理化参数；
[0009] S4、根据藻细胞的生物效应参数计算农药杀菌剂对藻细胞的半数效应浓度EC5〇,判 断农药杀菌剂的毒性。
[0010] 上述的方法，优选的，所述Sl步骤具体为：将农药杀菌剂与BGll培养基稀释液混 合，配制成梯度浓度的试验药液。
[0011] 上述的方法，优选的，所述培养基稀释液为将BGll培养基稀释10倍后的溶液。
[0012] 上述的方法，优选的，所述步骤S2中所述生物藻原液为处于对数生长期的纯种藻。
[0013] 上述的方法，优选的，所述、藻稀释液中藻细胞的浓度为1.0 XIO4~1.0 X IO5个/ mL〇
[0014] 上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述，试验药液与所述藻稀释液的体积比为1: Io
[0015] 上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述培养的条件为:温度为21°C~24tC、光照 强度为4440Lux~8880Lux、光照比为16h/8h。
[0016]上述的方法，优选的，培养期间，每隔24h摇动三角瓶中溶液的次数不少于5次。
[0017] 上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述藻细胞的生物反应效应包括藻细胞的抑 制率和藻细胞的中毒情况;所述藻细胞的中毒情况包括:藻细胞畸形、藻液变白、藻细胞体 积变小、藻细胞粘连或聚结。
[0018] 上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述试验液的理化参数包括:试验液的水温、 pH值和光照强度。
[0019] 上述的方法，优选的，所述步骤S4中采用统计软件SPSS，以农药杀菌剂浓度的对数 值为自变量X，以抑制率的机率值(抑制机率值即藻细胞的浓度变化值)为因变量y，建立毒 力回归方程，计算受试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC 50。
[0020]上述的方法，优选的，所述步骤S4中所述农药毒级判断标准为EC5Q<0.3mg a.i./ L，高毒；0.300<EC5〇<3.00mg a.i./L，中毒;EC5〇>3.0mg a.i./L，低毒。
[0021] 上述的方法，优选的，所述模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法还设有空白对 照组，所述空白对照组以藻稀释液与培养基的混合物培养生物藻。
[0022] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0023] (1)本发明提供了一种操作简便、实用性强的模式生物藻类筛选农药杀菌剂毒性 的方法;该方法可初步判断出农药杀菌剂的毒性，速度快，精确度高。
[0024] (2)本发明提供了一种模式生物藻类测定农药杀菌剂毒性的方法，急性毒性试验 周期短，评价终点容易判断，具有简单、易操作的优势。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的 保护范围。
[0026] 实施例
[0027]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0028] 实施例1:
[0029] -种本发明的模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法，包括以下步骤：
[0030] Sl、试验药液的配制：
[0031] 配制BGll培养基稀释液:按照表1的配方配制BGll培养基配方，其制备方法为:将 表1中的成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000 rnL容 量瓶中，并用蒸馏水定容至1000 mL，在121°C下高压灭菌15min，密封并贴好标签，4°C冰箱保 存，有效期2个月。将BGll培养基用蒸馏水稀释10倍后即为BGll培养基稀释液。
[0032] 称取50%苯醚甲环唑悬浮剂O.lOOOg，以BGll培养基稀释液溶解并定容至IOOmL容 量瓶，得到浓度为500mg a.i./L的储备液。依次移取上述储备液0.100、0.200、0.400、 0.800、1.600、3.200mL于250mL容量瓶中，用8611培养基稀释液定容至25〇11^，得到浓度分别 为0·200、0·400、0.800、1·60、3·20、6.40mg a.i./L的试验药液。
[0033] 表1: BGl 1培养基配方
[0035] S2、藻稀释液的配制：用血球计数法测定藻原液(羊角月牙藻）的细胞浓度为4.00 X IO6个/mL，并用无菌水稀释100倍得到藻稀释液，藻稀释液中藻细胞浓度为4.OOX IO4个/ mL〇
[0036] S3、染毒：
[0037]实验组:取步骤Sl中配制的梯度浓度的实验药液50mL分别加入步骤S2中50mL的藻 稀释液，得到梯度浓度的生物藻用培养基。试验中藻起始浓度为2.00 X IO4个/mL。
[0038] 空白对照组:取50mL藻稀释液与50mL BGl 1培养基稀释液混匀得到生物藻用培养 基。
[0039]分别将实验组和空白对照组的生物藻用培养基装入三角瓶中，用锡箱纸封口，并 置于智能人工气候箱中培养，控制在光照条件下放置16h，黑暗环境下放置8h;每天白天每 隔2小时摇动1次，共摇动5次。
[0040] S4、试验数据记录：
[0041 ] 测得试验期间各浓度组的水温为22.2°C~23.5 °C，pH值为6.88~7.26，培养箱中 的光照强度为5200LUX~5650LUX。染毒后48h、72h受抑制藻液细胞体积变小，观察并记录染 毒后Oh、24h、48h、72h藻细胞浓度(具体数据见表2)。
[0042]表2:50 %苯醚甲环唑悬浮剂对羊角月牙藻生长抑制试验数据记录表
[0044] 注：f表示藻细胞平均浓度(个/mL)
[0045] S5、数据处理：
[0046]采用统计软件SPSS12.0，以药剂浓度的对数值为自变量X，以（校正)抑制率的机率 值为因变量y，建立毒力回归方程。计算该供试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC50和 95%置信限，计算结果列于表3中。
[0047]表3:50 %苯醚甲环唑悬浮剂对羊角月牙藻生长抑制试验结果表
[0049] 通过上述方法计算得到50 %苯醚甲环唑悬浮剂对羊角月牙藻生长抑制的EC50 (72h)为0.759mg a.i./L，95%置信限为0.603~0.973mg a.i./L。
[0050] S6、结果评价：
[0051] 根据EC5q值判断农药毒级。农药对藻类的生长抑制毒性按EC5Q(72h)的大小划分为 三个等级：高毒(EC 5〇< 0.300mg a.i./L);中毒（0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L); 低毒(EC5〇>3.00mg a.i./L)。
[0052] 在本试验条件下，50%苯醚甲环唑悬浮剂对羊角月牙藻生长抑制的EC5Q(72h)为 0.759mg a.i./L，0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L，毒性等级为"中毒"。
[0053] 实施例2
[0054] 一种本发明的模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法，包括以下步骤：
[0055] 1、试验药液配制：
[0056] 移取80克/升戊唑醇悬浮种衣剂0.625mL，以BGll培养基稀释液(BGll稀释液的成 分与实施例1相同）溶解并定容至IOOmL容量瓶，得到浓度为500mg a. i . /L的储备液。依次移 取上述储备液〇. 300、0.600、1.200、2.400、4.800mL，分别用BGl 1培养基稀释液定容至250mL 容量瓶中，配制成浓度为〇. 600、1.20、2.40、4.80、9.60mg a. i . /L的2倍试验药液。
[0057] S2、藻稀释液的配制：用血球计数法测定藻原液(羊角月牙藻）的细胞浓度为4.00 X 1〇6,并用无菌水稀释100倍得到藻稀释液，藻稀释液中藻细胞浓度为4.OOX IO4个/mL。 [0058] S3、染毒：
[0059]实验组:取步骤Sl中配制的梯度浓度的实验药液50mL分别加入步骤S2中50mL的藻 稀释液，得到梯度浓度的生物藻用培养基。试验中藻起始浓度为2.00 X IO4个/mL。
[0060] 空白对照组:取50mL藻稀释液与50mL BGll培养基稀释液混匀。
[0061] 分别将实验组和空白对照组的生物藻用培养基装入三角瓶中，用锡箱纸封口，并 置于智能人工气候箱中培养，控制在光照条件下放置16h，黑暗环境下放置8h;每天白天每 隔2小时摇动1次，共摇动5次。
[0062] S4、试验数据记录：
[0063] 测得试验期间各浓度组的水温为22. (TC~23 . TC，pH值为6.74~7.16，培养箱中 的光照强度为5200LUX~5700LUX。染毒后48h、72h受抑制藻液细胞体积变小，观察并记录染 毒后Oh、24h、48h、72h藻细胞浓度(具体数据见表4)。
[0064]表4:80克/升戊唑醇悬浮种衣剂对羊角月牙藻生长抑制试验数据记录表
[0067] 注：T表示藻细胞平均浓度(个/mL)
[0068] S5、数据处理：
[0069]采用统计软件SPSS12.0，以药剂浓度的对数值为自变量X，以（校正)抑制率的机率 值为因变量y，建立毒力回归方程。计算该供试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC50和 95%置信限，计算结果列于表5中。
[0070]表5:80克/升戊唑醇悬浮种衣剂对羊角月牙藻生长抑制试验结果表
[0072]通过上述方法计算得到80克/升戊唑醇悬浮种衣剂对羊角月牙藻生长抑制的EC50 (72h)为 1.37mg a.i./L，95%置信限为 1.15~1.66mg a.i./L。
[0073] S6、结果评价：
[0074] 根据EC5q值判断农药毒级。农药对藻类的生长抑制毒性按EC5Q(72h)的大小划分为 三个等级：高毒(EC5〇< 0.300mg a.i./L);中毒（0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L); 低毒(EC5〇>3.00mg a.i./L)。
[0075] 在本试验条件下，80克/升戊唑醇悬浮种衣剂对羊角月牙藻生长抑制的EC5Q(72h) 为1.37mg a.i./L，0.300mg a.i./L<EC5〇<3.00mg a.i./L，毒性等级为"中毒"。
[0076] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽 然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人 员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内 容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此， 凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单 修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 将农药杀菌剂配制成梯度浓度的试验药液； 52、 将生物藻原液用无菌水稀配制成藻稀释液； 53、 将所述试验药液与所述藻稀释液混合，密封条件下培养72h，每隔24h对藻细胞计 数，并记录藻细胞的生物效应和试验液的理化参数； 54、 根据藻细胞的生物效应参数计算农药杀菌剂对藻细胞的半数效应浓度EC5Q，判断农 药杀菌剂的毒性。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1步骤具体为:将农药杀菌剂与培养 基稀释液混合，配制成梯度浓度的试验药液;所述培养基稀释液为将BG11培养基稀释10倍 后的溶液。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述生物藻原液为处于对数 生长期的纯种藻。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述，试验药液与所述藻稀 释液的体积比为1:1，所述藻稀释液中藻细胞的浓度为1. 〇 X 1〇4~1. 〇 X 1〇5个/mL。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述培养的条件为:温度为 21°C~24°C、光照强度为4440Lux~8880Lux、光照比为16h/8h;培养期间，每隔24h将所述试 验药液与所述藻稀释液的混合液摇动5次以上。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述藻细胞的生物效应包括 藻细胞的抑制率和藻细胞的中毒情况;所述藻细胞的中毒情况包括:藻细胞畸形、藻液变 白、藻细胞体积变小、藻细胞粘连或聚结。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述试验液的理化参数包 括:试验液的水温、pH值和光照强度。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中采用统计软件 SPSS，以农药杀菌剂浓度的对数值为自变量X，以抑制率的机率值为因变量y，建立毒力回归 方程，计算受试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC 50。9. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中所述农药毒级 判断标准为EC5〇<0.3mg a.i./L，高毒；0.300<EC5〇<3.00mg a.i./L，中毒；EC5〇> 3 · Omga · i · /L，低毒。10. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述模式生物藻测定农药杀 菌剂毒性的方法还设有空白对照组，所述空白对照组以藻稀释液与培养基的混合物培养生 物藻。
【文档编号】G01N33/00GK105842399SQ201610185811
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】刘勇, 张德咏, 罗香文, 陈源, 蒋桂芳, 罗杰, 陈昂, 奚庆, 罗源华, 刘志邦, 严清平, 何安頔, 刘建宇
【申请人】湖南省植物保护研究所