本发明涉及具有抑菌功能的剑叶龙血树提取物，尤其涉及该提取物及其芪类单体化合物作为抑制植物病原菌的抑菌剂的应用。
背景技术：
树脂有天然树脂和人工树脂之分，天然树脂是植物渗出植株外的萜类化合物因受空气氧化而形成的固态或半固态物质，不溶于水。本发明就是从剑叶龙血树分泌的树脂中提取出来的，剑叶龙血树的树皮被割破之后会分泌出殷红的汁液，这种红色的汁液即为龙血竭，具有活血化瘀、镇痛止血等功效，有极好的开发利用前景。
农药在农业生产中发挥着十分重要的作用，随着人们健康意识的提高，对农产品品质要求的提高，市场对农药的安全环保性要求也越来越高。由于传统农药存在着不可克服的环境污染及引起病虫害抗性等方面的严重问题，人们越来越重视生态合理的有效控制病虫害新方法的研究。从天然产物筛选出安全高效的化合物，直接开发为新的生物农药或以其为模型合成新的更安全高效的农药是创新生物农药发展的主要方向。其中，植物源抑菌剂由于其解决了传统农药的环境污染及病菌易产生抗性两大主要问题，因而越来越受到科学界及产业界的重视，成为新型生物农药研究的一个重要分支。例如，对多菌灵、百菌清等杀菌剂的研究都很成功，为防治一些世界性害虫做出了重要贡献。但未发现利用芪类化合物制备抑菌剂的报道。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种天然植物来源的抑菌剂，所述抑菌剂来源于剑叶龙血树，主要有效成分为芪类化合物，其对植物病原菌均有良好的抑制作用。
本发明技术方案如下：
一种具有抑菌功能的剑叶龙血树提取物，所述剑叶龙血树提取物是从剑叶龙血树(Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen)的树脂中提取所得的提取物。
所述剑叶龙血树提取物中含有具有下述化学式I、II、III所示的芪类化合物，
上述获得的提取物中，所述化学式III所示化合物占化学式I、II、III所示化合物总量的60～70wt.％。
本发明所述具有抑菌功能的剑叶龙血树提取物，优选由下述方法制备：利用有机溶剂直接浸提剑叶龙血树的树脂，再将浸提液进行浓缩蒸发，得到剑叶龙血树树脂总提取物，其中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、氯仿或丙酮。
进一步地，所述剑叶龙血树的树脂与有机溶剂的比例为1g：5～50mL。
进一步地，所述浸提为一次或多次，优选为3～5次，最优选为3次。
进一步优选地，所述具有抑菌功能的剑叶龙血树提取物由下述方法制备：将剑叶龙血树树脂总提取物利用MCI柱色谱进行粗分离，依次利用甲醇与水体积比为2:8、4:6、6:4、8:2的混合溶剂洗脱，得4级馏分F1、F2、F3、F4，所得馏分F3含有具有化学式I、II、III所示的芪类化合物。
上述技术方案中，利用不同配比关系的甲醇/水混合溶剂进行洗脱，分别利用甲醇与水的体积比为2:8、4:6、6:4、8:2的混合溶剂进行洗脱，依次获得F1(甲醇与水的体积比为2:8)、F2(甲醇与水的体积比为4:6)、F3(甲醇与水的体积比为4:6)、F4(甲醇与水的体积比为8:2)共4级馏分。
本发明的另一目的是提供上述剑叶龙血树树脂提取物作为抑制植物病原菌的抑菌剂的应用。
上述剑叶龙血树树脂提取物包括上述剑叶龙血树树脂总提取物和馏分F3。
进一步的，所述植物病原菌为玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、新月弯胞菌、禾谷镰刀菌、腐霉菌、黑粉菌、烟草黑胫病菌。
本发明的又一目的是提供含有上述剑叶龙血树树脂提取物的抑菌制剂，该制剂由所述剑叶龙血树总提取物和药学上可接受的辅料组成。
上述制剂形式优选为乳剂、水剂、水乳剂、可湿型粉剂，进一步优选为乳剂或水乳剂。
本发明的另一目的是提供由所得剑叶龙血树树脂提取物中提取剑叶龙血树树脂单体化合物的方法，所述单体化合物为具有下述化学式I、II或III所示的芪类化合物，
一种具有抑菌功能的剑叶龙血树提取物单体化合物，所述单体化合物为具有化学式I、II、III之一所示的芪类化合物，其按下述方法制备：将馏分F3通过硅胶柱分离得到馏分F3a和F3b，将F3a馏分进行凝胶柱层析和反相半制备色谱分离纯化，分别得到具有化学式I的化合物和具有化学式II的化合物；将F3b馏分进行凝胶柱色谱分离纯化，得到具有化学式III的化合物。
进一步地，F3通过硅胶柱(二氯甲烷/丙酮，4:1，v/v)分离得到馏分F3a和F3b。
进一步地，在Sephadex LH-20层析柱(丙酮为洗脱溶剂)上对亚组分F3a进行色谱分离，最后通过反相半制备HPLC(42％甲醇水；3mL/min；Eclipse XDB-C18 column，5μm，9.4×250mm)纯化，分别得到具有化学式I的化合物(本文中简称化合物I)和具有化学式II的化合物(本文中简称化合物II)。
进一步地，将馏分F3b在Sephadex LH-20层析柱(丙酮为洗脱溶剂)上进行柱色谱分离，得到具有化学式III的化合物(本文中简称化合物III)。
本发明的另一目的是提供上述具有化学式I、II或III所示的芪类化合物中的至少一种作为抑制植物病原菌的抑菌剂的应用。
进一步地，所述具有化学式I、II或III所示的芪类化合物中的一种可单独作为抑菌剂使用，也可两种组合或三种组合使用。抑菌剂中含有两种或三种化合物时，可按任意比例配合使用。
进一步的，所述植物病原菌为玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、新月弯胞菌、禾谷镰刀菌、腐霉菌、黑粉菌、烟草黑胫病菌。
本发明的又一目的是提供含有上述具有化学式I、II或III所示的芪类化合物的抑菌制剂，该制剂由具有化学式I、II或III所示的芪类化合物中的至少一种和药学上可接受的辅料组成。
上述制剂形式优选为乳剂、水剂、水乳剂、可湿型粉剂，进一步优选为乳剂或水乳剂。
本发明的有益效果为：本发明从植物剑叶龙血树的树脂中制备树脂总提取物，通过植物化学分离手段鉴定主要功能物质为3个新的天然芪类化合物(化合物I、II、III)，并对得到的树脂总提取物、芪类化合物及组合物进行了抗菌活性检测和实体活性验证，本发明的树脂总提取物和芪类化合物对植物病原真菌具有广谱的抑制活性，抑制中浓度范围在3.27～46.38μg/mL之间。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1剑叶龙血树树脂总提取物的制备：
取剑叶龙血树的树脂10.5g，甲醇(3×0.3L)提取3次，浓缩甲醇并蒸干后即可得到剑叶龙血树树脂总提取物1.8g。TLC分析发现，树脂总提取物中主要物质为芪类化合物。
实施例2芪类化合物I、II、III的分离与鉴定：
称取1.5g树脂总提取物，使用MCI柱色谱进行粗分离，用甲醇/水(2:8、4:6、6:4、8:2，V/V)依次进行洗脱，得到4个馏分(级分F1～F4)，其中F3通过硅胶柱(二氯甲烷/丙酮，4:1，v/v)，进一步分离得到馏分F3a和F3b。在Sephadex LH-20层析柱(丙酮为洗脱溶剂)上对亚组分F3a进行色谱分离，最后通过反相半制备HPLC(42％甲醇水；3mL/min；Eclipse XDB-C18 column，5μm，9.4×250mm)纯化，得到化合物I和化合物II。将馏分F3b在Sephadex LH-20层析柱(丙酮为洗脱溶剂)上进行柱色谱分离得到化合物III。通过核磁波谱数据(表1)结合质谱分析解析出化合物I、II、III的化学结构。
表1化合物I、II、III光谱数据1H(600MHz)和13C NMR(150MHz)
根据表1的NMR数据，得出芪类化合物I、II、III的结构，如下述化学式所示：
实施例3实施例1所得剑叶龙血树树脂总提取物的抗菌活性检测：
采用选择性抗菌活性测定方法测定剑叶龙血树树脂提取物对烟草黑胫病菌、禾谷镰刀菌、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、新月弯胞菌的抗菌活性。利用二倍稀释法对剑叶龙血树树脂总提取物进行抗菌活性测试。菌株在28℃的PDA上生长一周。将马铃薯葡萄糖培养液(PDB)洗脱平板上的真菌孢子，使洗脱液的孢子浓度为105个/mL。然后将100μL每种孢子悬浮液加入96孔板中。添加2μL DMSO溶解的提取物，提取物浓度范围为4～256μg/mL；同时以DMSO溶剂作为阴性对照，制霉菌素为阳性对照。使用40rpm的孵育振荡器48小时后，用分光光度计在625nm处读取微量滴定板的孔。计算50％抑制率(IC50)(见表2)。
表2剑叶龙血树树脂提取物抗菌活性测定(IC50，μg/mL)
实施例4芪类化合物I、II、III的真菌抑制活性：
采用二倍稀释发测试化合物I、II、III对玉米大斑病菌、新月弯胞菌、禾谷镰刀菌、黑粉菌、玉米小斑病菌的抗菌活性。测试结果表明，本发明所述芪类化合物对供试菌均具有很强的抑菌活性(见表3)。
表3芪类化合物I、II、III的抗菌活性测定(IC50，μg/mL)
实施例5芪类化合物I、II、III组合物的抗菌活性检测：
利用二倍稀释法测试化合物I、II、III的组合物对腐霉菌、新月弯胞菌、禾谷镰刀菌、黑粉菌、玉米小斑病菌的抗菌活性。将化合物I、II、III分别按照1:1:0、1:2:0、2:1:0、1:0:1、1:0:2、2:0:1、0:1:1、0:1:2、0:2:1、1:1:1、1:1:2、1:1:3的比例混合配制。测试结果表明，本发明所述芪类化合物组合物对供试菌均具有很强的抑菌活性(见表4)。
表4芪类化合物I、II、III的组合物抗菌活性测定(IC50，μg/mL)
实施例6剑叶龙血树树脂总提取物抗菌乳剂的制备：
取实施例1所得剑叶龙血树树脂总提取物1g，加入松节油1.5g，乳化剂2.5g，研磨使成初乳，之后再加入稳定剂1g，有机溶剂4g，pH值调节剂0.1g，充分混合搅拌乳化，即得抗菌乳剂。
实施例7 0.5％芪类抑菌剂的制备：
1、成分配比(质量百分比)：
化合物I含量：0.1％，化合物II：0.1％，化合物II：0.3％，水：15％，乳化剂：18％，稳定剂：6.4％，甲醇：60％，pH值调节剂：0.1％
2、制备方法：溶剂百分比例混配法
先将化合物I、化合物II、化合物III用部分甲醇溶解，按上述配比设定的化合物含量比例混合，搅拌均匀，静置半个小时，待其稳定后，再加入相应量的乳化剂、稳定剂、余量甲醇、pH值调节剂搅拌均匀即可。
实施例8 0.8％芪类化合物抑菌剂的制备：
1、成分配比(质量百分比)：
化合物I：0.2％，化合物II：0.1％，化合物III：0.5％，水：18％，乳化剂：20％，稳定剂：7％，甲醇：54％，pH值调节剂：0.2％
2、制备方法：溶剂百分比例混配法
先将化合物1、化合物2、化合物3用部分甲醇溶解，按上述配比设定的化合物含量比例混合，搅拌均匀，静置半个小时，待其稳定后，再加入相应量的乳化剂、稳定剂、余量甲醇、pH值调节剂搅拌均匀即可。