一株猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用的制作方法

本发明属于猪的免疫预防技术领域，尤其涉及一种猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用。

背景技术：

猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)是冠状病毒科δ冠状病毒属的一个新成员，能造成母猪和仔猪的腹泻、呕吐、脱水，严重可致死，给养猪场及养殖业造成了严重的经济损失。2012年，该新型冠状病毒在中国香港被首次发现。2014年初，美国俄亥俄州的猪场爆发了母猪和仔猪腹泻病，经检测为pdcov阳性，并且在美国的至少18个州中也相继检测到了该新型猪冠状病毒。随后，在韩国以及加拿大的腹泻仔猪的粪便样品中也检测到了pdcov。在中国，2013年～2014年，对从江苏、广东、安徽、湖北、河南等省市的养猪场中采集的258份粪便样本进行检测后发现，pdcov阳性率达到14.3％，首次证实在中国内地存在pdcov。2015年至今，在我国其他省市，如陕西、甘肃、浙江、河北、天津等地区也陆续检测到pdcov。目前，由pdcov所致的猪腹泻疾病呈世界流行和逐渐扩散的趋势。与猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)相同，pdcov也是引起猪腹泻疾病的常见病原之一。该病毒对不同日龄的猪均可致病，对仔猪有较强的致病性，表现为持续腹泻、呕吐，严重时会因脱水致死，病死率一般为30％～40％。但pdcov是一种近年来刚刚发现的新型病原，目前在世界范围内尚未研制出针对该病的有效疫苗或药物。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于一种猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用；所述猪德尔塔冠状病毒毒株免疫保护效果好，能够用于制备疫苗。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒毒株，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.17383。

本发明提供了包括所述的猪德尔塔冠状病毒毒株s基因组的重组载体。

本发明提供了所述猪德尔塔冠状病毒毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

优选的，所述猪流行性腹泻疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗。

优选的，所述灭活疫苗包括灭活的所述猪德尔塔冠状病毒和辅助剂。

本发明提供了所述的重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。

优选的，所述猪流行性腹泻疫苗包括亚单位疫苗。

本发明的有益效果：本发明提供的猪德尔塔冠状病毒毒株，在侵染细胞第一代就出现了典型致细胞病变效应cpe，毒性强；将所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活后制备猪流行性腹泻病毒，免疫效果好。根据本发明实施例记载，用所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活疫苗免疫仔猪，在免疫后7天即可引起igg抗体的显著升高，并在免疫后14、21天持续升高，且抗体水平显著高于阴性对照组(pbs)；进一步地攻毒保护试验结果显示，所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活苗能够保护4/5的仔猪抵抗100个tcid50同源毒株的攻击，而阴性对照组则全部发病(0/5保护)，可见所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活苗免疫效果好。

附图说明

图1为所述猪德尔塔冠状病毒毒株70代cpe的显微镜图片；

图2为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的系统进化树；

图3为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的生长曲线；

图4为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的ifa鉴定图；

图5为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的病毒粒子形态图；

图6为所述猪德尔塔冠状病毒毒株的致病性分析，其中a为临床特征图，b为剖检病变图；

图7为感染所述猪德尔塔冠状病毒毒株后仔猪的肠道病理变化的组织病理观察图；

图8为用所述猪德尔塔冠状病毒毒株灭活疫苗免疫仔猪后的igg抗体水平。

生物保藏说明

本发明提供的猪德尔塔冠状病毒ch/xjyn03/2016于2019年02月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.17383。

具体实施方式

本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒毒株，所述猪德尔塔冠状病毒毒株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.17383。本发明中，所述猪德尔塔冠状病毒毒株分离自中国新疆，所述猪德尔塔冠状病毒毒株与其它pdcov参考毒株在处于同一个分支，并且亲缘关系相近，同属δ冠状病毒属；而与α冠状病毒属的tgev和pedv差异性较大，不在同一分支。本发明中，所述猪德尔塔冠状病毒粒子形状大致呈椭圆形，直径约100nm左右，四周有明显的似皇冠状的纤突，为冠状病毒的典型特征。

本发明将所述猪德尔塔冠状病毒毒株阳性样品接种vero细胞传代培进行传代培养，所述猪德尔塔冠状病毒毒株在第一代就出现了典型cpe；本发明中，所述猪德尔塔冠状病毒毒株p0代和p20代毒价分别为10^4.65tcid50/ml和10^5.57tcid50/ml。

本发明提供了包括所述的猪德尔塔冠状病毒毒株s基因组的重组载体。在本发明中，所述猪德尔塔冠状病毒毒株s基因组优选的通过以下方法制备获得：a)提取包括所述猪德尔塔冠状病毒毒株的样品的总rna；b)利用s基因组特异性引物，以所述总rna为模板进行rt-pcr反应获得所述猪德尔塔冠状病毒毒株s基因组。在本发明中，包括所述猪德尔塔冠状病毒毒株的样品优选为田间粪便样品或细胞培养病毒液；本发明中，所述总rna的提取的方法采用本领域常规的病毒总rna提取方法，无其他特殊要求。本发明中，所述s基因组特异性引物包括a片段引物对、b片段引物对和c片段引物对；所述a片段引物对、b片段引物对和c片段引物对的核苷酸序列如seqidno：1～6所示。本发明中，所述rt-pcr反应优选的采用gxldnapolymerase试剂盒进行；所述rt-pcr反应的扩增体系以50μl计，优选的包括如下组分：

所述rt-pcr反应的扩增程序优选的如下：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min；4℃保存。

本发明中，所述rt-pcr扩增反应的产物即为所述猪德尔塔冠状病毒毒株s基因组。在本发明中，优选的将所述rt-pcr扩增产物与载体链接获得重组载体。在本发明中，所述载体以及连接方法采用本领域常规载体及连接方法即可，无其他特殊要求。在本发明具体实施过程中，所述载体优选为平末端连接载体pcr-xl-2topo载体。本发明中所述重组载体能够用于所述猪德尔塔冠状病毒s基因组的克隆和鉴定；所述重组载体还能够用于亚单位疫苗的制备。

本发明还提供了所述猪德尔塔冠状病毒毒株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。在本发明中，所述猪流行性腹泻疫苗优选包括灭活疫苗和减毒疫苗；所述灭活疫苗优选的包括灭活的所述猪德尔塔冠状病毒和辅助剂；本发明对所述辅助剂的种类和用量没有特殊限定，采用本领域常规的疫苗辅助剂即可。本发明中，所述减毒疫苗优选的通过对所述猪德尔塔冠状病毒毒进行减毒获得；所述减毒的方法采用本领域常规的病毒减毒方法即可。

本发明还提供了所述的重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。本发明中，所述猪流行性腹泻疫苗优选的包括亚单位疫苗，更优选为基因工程亚单位疫苗。本发明对所述疫苗的制备方法没有特殊要求，采用本领域常规的疫苗制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1病料与细胞

病料采集自中国新疆，12份含有pdcov阳性毒株的样品用于pdcov的分离鉴定；llc-pk-1细胞由本实验室冷冻保存。该细胞由含10％fbs和1％双抗的mem培养基进行传代培养。

2pdcovch/xjyn03/2016毒株s基因组序列测定

根据已公布的pdcov序列比对结果选取保守区域，设计相应扩增引物进行pdcov的s基因组序列扩增，引物情况如表1所示。将ch/xjyn03/2016毒株田间粪便样品以及细胞培养病毒液rna提取后，利用s基因组特异性引物进行rt-pcr反应。选用平末端连接载体pcr-xl-2topo载体进行pcr片段的亚克隆，将酶切鉴定正确的质粒送至公司测序。

表1pedv的s基因组扩增引物

rna提取(qiagenrneasyminikit)

1)取3次反复冻融后的病毒液350μl，加入350μlrlt裂解液后缓慢混匀，冰上静置5min；

2)加入700μl无水乙醇，缓慢混匀后冰上静置5min；

3)将700μl的混合液加入到离心柱中，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的液体并将离心柱放回收集管中；

4)向离心柱中加入700μl的rw1缓冲液，冰上静置1min，12000rpm离心30s后将离心柱放置到新的收集管中；

5)吸取500μlrpe缓冲液，12000rpm离心15后弃掉收集管中液体；

6)再次加入rpe缓冲液500μl，12000rpm离心2min后弃掉液体12000rpm空离1min；

7)空离后将柱子放入已灭菌的1.5mleppendorf管中，加入30μl无rna酶的水，静置1min后离心收集病毒rna，-20℃储存备用。

rt-pcr反应

以反转录获得的cdna为模板，利用gxldnapolymerase试剂盒进行pcr扩增反应。

表2rt-pcr反应体系

pcr反应程序：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min；4℃保存。

3pdcovch/xjyn03/2016毒株遗传进化分析

从genebank获取多株国内外具有代表性的pdcov毒株全基因组序列，与本实验ch/xjyn03/2016毒株的全基因组序列利用mega6.0软件进行序列比对及邻接法(bootstrapreplication：1000)构建系统进化树。

利用设计的特异性引物扩增pdcovch/xjyn03/2016的s基因组序列，将测定序列拼接成完整的全基因组序列，利用mega6.0软件与已知的pedv毒株全基因组序列比对且构建系统进化树。结果如图2显示，该ch/xjyn03/2016毒株与其它pdcov参考毒株在处于同一个分支，并且亲缘关系相近，同属δ冠状病毒属；而与α冠状病毒属的tgev和pedv差异性较大，不在同一分支。

4.pdcovch/xjyn03/2016的分离与传代培养

1、取1.5ml冻存的病毒液，用0.22um滤器过滤除菌。吸取1ml上述过滤的病毒液，加入2mlmmt(trypsin终浓度则为20ug/ml)，震荡混匀之后室温放置10min备用。

2、取出生长状态良好且几乎铺满细胞瓶的单层llc-pk-1细胞，用接近室温的dpbs洗涤3遍后，加入步骤2中准备的毒液，然后置于含有5％co2的37℃温箱孵育1h，每隔20min摇匀一次。

3、孵育结束后补加5ml新鲜的mmt(trypsin浓度为20ug/ml)后置于温箱孵育培养。

4、每隔一段时间观察细胞是否出现cpe，收毒后继续传代。

结果如图1所示：将12份含有pdcov阳性毒株的样品接种vero细胞传代培养，其中pdcovch/xjyn03/2016毒株在第一代就出现了典型cpe，选择该毒株继续进行传代培养，目前已经传至45代，正致力于毒株的致弱。该毒株在细胞中从hpi12开始出现cpe，细胞皱缩且变圆，聚集成团，形成合胞体；随着感染时间增加，细胞病变面积增大，hpi48细胞已经完全病变，并且出现脱落现象，形成细胞空泡。

5.pdcovch/xjyn03/2016毒株生长曲线

将铺满单层细胞的60dish用pbs清晰3次，加入500μl病毒液(胰酶浓度20μg/ml)，37℃孵育1h后，补加1.5ml的mm，置于含有5％co237℃培养。在感染后不同时间段收集毒液，置于-80℃冰箱内保存备用。运用qpcr测定病毒含量，绘制不同代次pdcovch/xjyn03/2016毒株的生长曲线，每隔10代测定一次。

所述mm培养基为maintenancemedium(mm)，制备方法：在500mldmem培养液(invitrogencat#12430054)中加入1wt％penicillin/streptomycin(invitrogen/gibcocat#15140122)，0.3wt％tryptosephosphatebroth(tpb,sigmacat#t8159-100ml)和终浓度为10μg/ml的胰酶(invitrogencat#15090-046)后，混合均匀。

结果由图3可知，在0～48h时，随着感染时间增加病毒含量逐渐增多，，在接毒后48h培养基中pedv病毒含量最高，相对应的正常细胞几乎90％病变；峰值过后，随着时间的延长细胞开始脱落从而毒粒子含量开始下降。

6pdcovch/xjyn03/2016毒株tcid50的测定

1、将经冻融收集的病毒液室温融化，3500rpm离心2min，取上清

2、用dmem培养基(胰酶浓度2020μg/ml)将病毒作连续10倍稀释，即10^-1,10^-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。

3、弃掉细胞培养液，pbs清洗2次；再用维持培养基(mm)洗一次，弃掉(保证孔内无液体残留)。

4、每个稀释度取100μl加入96孔板，每个稀释度作8个重复。在补加100μlmm，终体积为200μl。并设置空白对照，即200μlmm。

5、置于含有5％co237℃培养。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。一般需观察5～7天。结果的计算用reed-muench两氏法。

结果显示pdcovch/xjyn03/2016毒株p0代和p20代毒价分别为10^4.65tcid50/ml和10^5.57tcid50/ml。

7pdcovch/xjyn03/2016免疫荧光检查(ifa)

1、在6孔板中接种毒液，待细胞出现cpe后，弃掉维持培养基；

2、每孔加入1ml固定剂即4％多聚甲醛，放置于4℃冰箱，固定30min；

3、弃掉固定液，每孔加入1ml通透剂即0.25％tripon-100，室温通透10min，pbs洗板3次，每次5min；

4、5％bsa封闭60min，或10％bsa封闭30min，每孔1ml，封闭后，pbs洗板3次，每次5min；

5、每孔加入1ml以1:2000或1:5000稀释的抗pdcovn蛋白单克隆抗体，37℃孵育60min(或4℃过夜)。pbs洗板3次，每次5min；

6、在避光条件下，每孔加入1ml以1:2000稀释的488标记的抗鼠二抗，37℃孵育60min，pbs洗板3次，每次5min；

7、每孔加入两滴dapi(用少许pbs稀释)，室温5min，pbs洗板3次，每次5min，后荧光显微镜观察。

结果如图4所示，pdcov感染细胞后均检测到了特异性绿色荧光。同时，随着感染时间的增加，视野中绿色荧光越多，表明pdcov含量越高。

8pdcovch/xjyn03/2016电镜检测病毒粒子

1、收集400ml病毒液，反复冻融三次，10000rpm于4℃离心1h，收集细胞上清液。收集的细胞上清液过0.22μm滤膜。将50％peg-8000加入病毒上清液中，使其终浓度为10％，过夜沉淀病毒，4℃温和搅拌过夜。

2、将上述病毒液-peg8000混合液放入250ml离心管，12000rpm于4℃离心2h沉淀病毒。

3、tbs悬浮病毒沉淀，制备病毒-tbs混合液，4℃搅拌30min。

4、第一次蔗糖密度离心：将0.5m蔗糖溶液加到病毒上清液的底部，超速离心30000rpm3h，4℃。弃掉上清，用ph7.5tbs充分重悬沉淀，然后4℃3000rpm离心10min。

5、第二次蔗糖密度离心：将上述tbs重悬液加入到离心管中(提前加入40％和50％的蔗糖溶液)，30000rpm，4℃，离心3h。离心后吸取病毒带。

6、用尖头镊子夹取铜网置于封口膜上(铜网正面向上)，吸取约10μl毒液滴于铜网上，吸附约15min(操作过程要时刻注意不能混淆正反面)。

7、吸附时间到后用滤纸把铜网上面毒液吸干，然后风干约10min；

8、风干后吸取10μl2％磷钨酸钠水溶液滴于铜网上负染约20min；

9、负染时间到用滤纸吸干铜网上的溶液，风干约10min，夹取铜网置于铜网盒里面送去电镜。

结果如图5显示pdcovch/xjyn03/2016病毒粒子形状大致呈椭圆形，直径约100nm左右，四周有明显的似皇冠状的纤突，为冠状病毒的典型特征。

9pdcovch/xjyn03/2016毒株的纯化

待生长状态良好的llc-pk1细胞于6孔板单层铺满80％时，用dpbs清洗3次，每孔依次加入500μl10倍梯度稀释的病毒液(胰酶浓度：20μg/ml)，置于含有5％co2的37℃培养箱孵育1h。孵育后弃掉培养液，dpbs清洗1次，每孔加入2ml含有mem(胰酶浓度：20μg/ml)的1.5％低熔点胶。在室温下放置15min，待胶凝固后将其倒置放入温箱继续培养观察。待六孔板中出现cpe时，用无菌枪头挑取最低稀释度噬斑于1.5mlep管中。

10pdcovch/xjyn03/2016毒株对仔猪致病性分析

在规模化猪场采集血清及粪便样品，利用elisa试剂盒检测仔猪血清是否存在pdcov抗体，且利用qpcr检测仔猪是否存在pdcov的感染。选取检测合格的7日龄仔猪提前在动物房饲养3天，确保实验动物适应周边环境，减少应激反应。将选取的7日龄仔猪随机分为2组，即g1、g2。每组4头仔猪，每组仔猪进行编号以便区分。g1为实验组，g2为对照组。将pdcovch/xjyn03/2016毒株p10代毒液用pbs10倍稀释，每头份2ml毒液，口服攻毒。对照组口服pbs。自攻毒日起，观察仔猪精神状态、饮食是否发现变化，是否出现腹泻症状。每天分三个时间段(9:00、15:00以及21:00)棉签拭子采集粪便样品，采集的粪便样品用2ml含双抗的mem处理，3500rpm离心30min，吸取上清液置于-80℃保存备用。提取rna，实时荧光定量pcr检测仔猪是否存在pedv感染。在仔猪频临死亡时，心脏处死，立刻剖检，观察肠道宏观变化。将肠道按十二指肠、空肠、回肠、盲肠以及结肠分别取2～3cm，置于10％甲醛溶液固定保存，进行组织病理观察。

仔猪攻毒前毛色、采食、体重均正常，且好动。攻毒后24～48h仔猪开始发病，粪便样品变稀，个别仔猪精神萎靡，食欲减退，肛门处发红。攻毒后48h，实验组所有仔猪均发病，出现严重的黄色水样腹泻，呈喷射状，且气味恶臭；肛门部位出现肿胀发红，后肢粪便污染严重；部分仔猪食欲废绝，进食后出现不同程度的呕吐现象；所有仔猪出现严重的消瘦，被毛脏乱无规则，喜卧，后肢无力，站立不稳，严重者后肢瘫倒在地，只能靠前肢滑行(见图6a)。对照组实验仔猪精神状态良好，饮食正常。将频临死亡的仔猪心脏处死，进行剖检。如图6b所示，肠粘膜充血肿胀，肠壁变薄变透亮，内含大量黄色水样内容物；肠系膜淋巴结出现不同程度的肿大。组织病理观察结果如图7所示。

11、pdcovch/xjyn03/2016毒株免疫保护效果评价

1)pdcovch/xjyn03/2016灭活苗制备：

(1)液体配置

0.2n氢氧化钠：无菌称取氢氧化钠0.8g，加灭菌水至100ml，充分摇匀。或按上述量配好后，高压灭菌。0.2mbei配置：无菌称取bea4.1g/0.41g，加入已灭菌的0.2n氢氧化钠溶液100ml/10ml，充分溶解，使bea浓度为0.2m，置37℃水浴中，当bea溶液温度平衡到37℃时，每15min摇振一次，共计1h，此时bea环化为0.2mbei(现配现用)。

(2)灭活

将p4、30、p70代细胞毒，经3500rmp离心10min除去细胞碎片，用7.5％碳酸氢钠溶液调ph值为7.6～7.8(试纸条7.5，15ml细胞毒加入150μl即可)，加入1％penicillin/streptomycin(gibcocat#15140122)。加入终浓度0.05％的福尔马林，即100ml病毒液中加入0.135ml37～40％的福尔马林(1ml：1.35μl)，充分摇匀。然后加入已配好的0.2mbei溶液，使bei终浓度为0.002m，即100ml病毒液中加入0.2mbei溶液1ml(1ml：10μl)，充分摇匀。升温至30℃计算灭活时间，温度保持在30±1℃，灭活12h，其间每隔2h摇振1次。

(3)乳化

细胞毒灭活抗原15ml+弗氏完全佐剂15ml(1:1混合)，用10ml注射器反复吸吹直至完全混匀(至少10～15次)。

2)攻毒保护试验的设计

选取pdcov抗体阴性仔猪10头，分为两组，即免疫组(n＝5)和阴性对照组(pbs，n＝5)。免疫组颈部肌肉注射2ml上述步骤中制备的灭活疫苗，对照组颈部肌肉注射2mlpbs。在免疫后0、7、14、21天分别通过前腔静脉采血并分离血清，通过间接elisa方法检测免疫后血清igg抗体水平。进一步地，首免后第21天，用100个tcid50的同源毒株对免疫组和对照组进行攻毒保护试验，进而对该毒株的免疫保护效果进行评价。

3)间接elisa方法

将真核表达的pdcovn蛋白抗原用包被缓冲液(0.1m碳酸盐缓冲液，ph9.0)稀释至终浓度为0.1μg/ml，包被于50μl/孔的96孔聚苯乙烯微滴定板上，并在4℃下孵育过夜。用pbs-t洗涤5次后，用含2％牛血清白蛋白的100μl/孔在pbs-t中37℃封闭2h，然后用pbs-t洗涤5次，然后以50μl/孔加入免疫仔猪血清样品(1：100稀释液)，37℃孵育60min，同时建立阳性、阴性和空白对照。孵育后，用pbs-t洗涤5次。然后加入50μl/孔20000倍稀释的hrp标记的山羊抗猪igg单克隆抗体。然后在37℃下孵育30min，然后用pbs-t洗涤5次，之后加入50μl/孔的tmb单组分底物溶液，在37℃下孵育15min。使用酶标板在450nm处测量每个孔的od值。

在免疫后igg抗体检测结果如图8所示，ch/xjyn03/2016毒株灭活苗在免疫后7天即可引起igg抗体的显著升高，并在免疫后14、21天持续升高，且抗体水平显著高于阴性对照组(pbs组)。进一步地攻毒保护试验结果显示，ch/xjyn03/2016毒株灭活苗能够保护4/5的仔猪抵抗100个tcid50同源毒株的攻击，而阴性对照组则全部发病(0/5保护)。因此，免疫保护结果表明，ch/xjyn03/2016毒株在制备成灭活疫苗后对仔猪具有良好的免疫保护效果，是一株良好、有效的候选疫苗毒株。

由此可见，本发明提供的所述猪德尔塔冠状病毒毒株，毒力强，免疫效果好，能够用于制备猪流行性腹泻疫苗，防治猪流行性腹泻。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一株猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

attatctatggtgatgattcca22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acaattcagcatgagtggtt20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caccagaatgcagagagctc20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccaaataccatagctccagtaa22

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggtggcagatctgctattgaa21

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gaccgctcttgtagatcattaat23