一种磷酸钙转染细胞的方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种磷酸钙转染细胞的方法。

背景技术：

将dna导入动物细胞中的方法很多，磷酸钙转染法经济简单而且对细胞无毒性，是目前做真核细胞转染最常用的方法之一。该法作为常规方法用于多种细胞的基因转染，可获得短暂或长期表达。但是随着该技术的广泛应用，人们发现在磷酸钙转染法中，影响转染成功与否及转染效率的高低的因素较多，经常造成转染的低效率和不稳定性。存在操作步骤多、耗时长，常常造成转染效率低和不稳定的情况。

如何用磷酸钙法提高质粒高效稳定的转染细胞是目前需要解决的一个问题。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种磷酸钙转染细胞的方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种磷酸钙转染细胞的方法，至少包括以下步骤：

1)将细胞接种于含有培养基的培养容器中贴壁培养，培养至所贴壁的培养容器壁总面积的60％-70％时即可开始转染，得到待转染的细胞；

2)制备磷酸钙-质粒dna沉淀：向质粒中加入cacl2水溶液，再加入无菌水，混匀，得到混合液一；

3)将与所述混合液一等体积的cacl2水溶液吹打起泡，得到泡沫混合液二；

4)将所述混合液一加入所述泡沫混合液二中，室温孵育得到混合液三；

5)给所述待转染的细胞更换新鲜培养基，静置；

6)将混合液三加入所述待转染的细胞所在的培养基中，混匀后孵育。

在一种实施方式中，步骤1)中，所述培养容器为培养皿。

在一种实施方式中，步骤2)中，所述质粒包括重组穿梭质粒和骨架质粒。

在一种实施方式中，步骤2)中，所述cacl2水溶液的摩尔浓度为2.5～3mol/l。可选的，为2.5mol/l。

在一种实施方式中，步骤3)中，所述cacl2水溶液与所述步骤2)中cacl2水溶液的摩尔浓度相同。

在一种实施方式中，步骤4)中，采用滴加法将所述混合液一加入到所述泡沫混合液二中。

在一种实施方式中，步骤4)中，将所述混合液一加入所述泡沫混合液二的过程在2min内完成。

在一种实施方式中，步骤6)中，采用滴加法将混合液三加入到所述待转染的293t所在的培养容器中。

在一种实施方式中，步骤6)中，孵育条件为5％co2，37℃。其中，co2浓度以体积分数表示。

在一种实施方式中，步骤6)中，孵育开始后18-24小时更换一次新鲜培养基。

在一种实施方式中，方法中用到的培养基均可选自10％fbs-dmem-f12。所述10％fbs-dmem-f12是指，含有体积分数为10％的fbs的dmem-f12完全培养基。其中，fbs是指牛胎血清。

在一种实施方式中，所述细胞为293t细胞。

本发明的有益效果为：

本发明所述的磷酸钙转染细胞的方法，将质粒dna高效稳定的导入细胞中，提高了转染效率，操作步骤简单、结果可靠、重复性好等特点。

附图说明

图1：重组腺病毒质粒ad-egfp在293t细胞中转染效率检测图(其中，a为光学显微镜观察图，b为荧光显微镜观察图，倍数均为：40倍)。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的药剂学，药物分析学，药物化学，分析化学，分子生物学、生物化学及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1、磷酸钙转染293t细胞的方法

1.实验方法

(1)转染前通过胰酶消化收集293t细胞，培养待细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的60％-70％时即可开始转染；

(2)制备磷酸钙-质粒dna沉淀：取一只ep管，加入重组穿梭和骨架质粒各10μg，再加入bufferb(cacl2)50μl(10×)，最后用灭菌水补足体系至500μl，轻轻混匀。所述bufferb的使用浓度为2.5mol/l。

(3)再取一只50ml的圆底试管，加入与上述等体积的bufferb(500μl)，用吸管将bufferb从底部吹打起泡(泡尽量大)，逐步缓慢的将步骤2中的配好的混合液滴加到bufferb中，这一步尽量在2min内完成，室温孵育30min；

(4)将待转染的细胞换液，弃去原培养液，加入新鲜培养基，注意此时不需要加10ml的培养液，5ml即可，以免对转染液过度的稀释；

(5)静置30min后，立即将1000μl的磷酸钙-质粒dna悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动培养皿混匀。

(6)将培养皿置于含5％co2的37℃温箱孵育过夜，次日早上用新鲜培养基更换培养液；

(7)转染后48h于倒置荧光显微镜下观察293t细胞中gfp的表达情况，计数表达绿色荧光细胞比例，检查转染效率。

2.实验结果

重组质粒转染293t细胞进行包装，转染48h后用荧光显微镜即可观察到荧光，荧光数量与转染效率有关，荧光阳性细胞率为85％±5％，间接反映该方法的转染效率为80％-85％(如图1)。相比直接氯化钙转染，改良吹泡法氯化钙转染法显著提高293t细胞转染效率(50±12％vs85％±5％，p＜0.001)。

实施例2

本发明还参照实施例1进行了其他条件的磷酸钙转染293t细胞的方法，并进行了实验观察。

条件1：与实施例1的区别在于，所述bufferb的使用浓度为3mol/l，步骤(6)中，转染18小时后更换培养基。其余皆相同。

条件2：与实施例1的区别在于，所述bufferb的使用浓度为2.7mol/l。步骤(6)中，转染24小时后更换培养基。其余皆相同。

显微镜观察结果显示，采用以上两种条件的磷酸钙转染293t细胞的方法转染效果良好，转染效率均在80％-85％之间。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。