苯乙酮类化合物、制备方法及制备治疗癌症药物的应用与流程

本发明属于医药领域，苯乙酮类化合物、制备方法及制备治疗癌症药物的应用，特别是1个苯乙酮类化合物、制备方法及其用于制备治疗肝癌药物或人恶性神经胶质瘤癌的应用。
背景技术：
：2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人；平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症[1]。恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，根据最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％。恶性肿瘤已成为我国居民死亡的主要原因之一，影响着国家社会的发展，因此肿瘤基础与临床防治研究成为目前以及未来中国科研与医疗领域需大力开展的重要工作内容，开发新的抗癌药物已经迫在眉睫。苯乙酮类衍生物存在于多种药用植物中，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗肿瘤[2]、抗真菌[3]等，除此之外，苯乙酮类化合物还是非常重要的医药中间体和料，广泛用于多种药物的合成。由于苯乙酮类化合物良好的生物活性和结构多变等特点，国内外对该类化合物进行了大量的衍生化研究和药理研究[4-7]。参考文献：[1]郑荣寿,孙可欣,张思维,等.2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2019,41(1):19-28.[2]马亚团.新型苯乙酮衍生物的合成及其生物活性研究[硕士学位论文].杨凌：西北农林科技大学,2012.[3]王景景.苯乙酮衍生物的合成及抗真菌生物活性研究[硕士学位论文].杨凌：西北农林科技大学,2011[4]Aguiar,F.L.L.de；Morais,S.M.de；Santos,H.S.dos；Albuquerque,M.R.J.R.；Bandeira,P.N.；Brito,E.H.S.de；Rocha,M.F.G.；Fontenelle,R.O.dosS.AntifungalactivityandsynergisticeffectofacetophenonesisolatedfromspeciesCrotonagainstdermatophytesandyeasts[J].MedicinalPlantsResearch,2016,10(17):216-222.46ref.[5]SoberónJ.R.,LizarragaE.F.,SgarigliaM.A.,CarrascoJuárezM.B.,Sampietro,D.A.,BenAltabefA.,CatalánC.A.N.,VattuoneM.A.,Antifungalactivityof4-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)acetophenoneagainstCandidaalbicans:evidencefortheantifungalmodeofaction[J].AntonievanLeeuwenhoek,2015,108(5):1047-1057.30ref.[6]RyuByeol,KimHyeMi,WooJeongHwa,ChoiJungHye,JangDaeSik.AnewacetophenoneglycosidefromtheflowerbudsofSyzygiumaromaticum(cloves)[J].Fitoterapia,2016,115:46-51.34ref.[7]KatsunoriMiyake,AiriSuzuki,ChihiroMorita,MasuoGoto,DavidJ.Newman,BarryR.O’Keefe,SusanL.Morris-Natschke,Kuo-HsiungLeeandKyokoNakagawa-Goto.AcetophenonemonomersfromAcronychiatrifoliolata[J].NaturalProducts,2016,79(11):2883-2889。技术实现要素：本发明通过合成的方法得到一个新的化合物，称为苯乙酮类化合物(acetophenones)，编号为BA36，其对肝癌细胞HepG2与人恶性神经胶质瘤瘤癌细胞U87有很强的抑制活性。本发明的苯乙酮类化合物的化学结构式为：本发明的苯乙酮类化合物的化学名称为：4-乙基-2,6-二溴代-3-羟苯基-3-苯丙酸酯，4-Acetyl-2,6-dibromo-3-hydroxyphenyl3-phenylpropanoate。本发明的苯乙酮类化合物的理化性质为：白色固体，熔点126～128℃，收率87％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(s,1H),7.46(d,J＝7.5Hz,2H),7.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.25(t,J＝7.0Hz,1H),2.92(m,2H),2.80(m,2H),2.64(s,3H).HR-ESI-MSm/zcalcd.forC17H14Br2O4[M–H]–:440.9246,实测值：440.9243.所述的苯乙酮类化合物用于制备治疗肝癌或人恶性神经胶质瘤癌药物的应用。所述的苯乙酮类化合物用于制备抗肝癌细胞HepG2或人恶性神经胶质瘤癌细胞U87药物或制剂的应用。本发明的化合物作为抗癌剂，在治疗抗肝癌与人恶性神经胶质瘤瘤癌方面具有开发应用潜力。附图说明图1为馏分的流出顺序示意图；图2为本发明苯乙酮类化合物的氢谱图；图3为本发明苯乙酮类化合物的碳谱图；图4为不同浓度的本发明的苯乙酮类化合物对HepG2细胞分裂周期分析图；图5为不同浓度的本发明苯乙酮类化合物对HepG2细胞凋亡分析图；以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。具体实施方式本发明的苯乙酮类化合物BA36是由2,4-二羟基苯乙酮经过溴代反应生成二溴取代苯乙酮，再与3-苯丙酰氯酰化，进一步纯化获得。一、本发明的化合物的合成方法、鉴定及抗肝癌细胞HepG2与人恶性神经胶质瘤癌细胞U87的活性测定及应用：1、实验材料试剂与仪器：常用有机溶剂：三氯甲烷，甲醇，乙酸乙酯，石油醚、丙酮等均为工业试剂，重蒸后使用。有机溶剂：正己烷，色谱甲醇，色谱乙腈等视实际使用情况使用分析纯或色谱纯试剂。反应底物为2,4-二羟基苯乙酮。活性测试：DMEM培养基，FBS血清，BI血清，PBS，胰酶。以下除特殊说明外，试剂用量均为体积比。常用仪器：旋光仪RudolphAutopolⅢ型；高效液相色谱仪：Waters1525；紫外光谱仪：ThermoEvolution-300型；核磁共振：BrukerAvanceⅢ500(以TMS为内标)；低分辨质谱仪：ThermoFisherLTQFleet型。增强版300mL半制备型高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司)；旋转蒸发仪：BüchiRotavaporR-101、R-3HB型；低温冷却液循环泵：DLSB-10/20型(郑州长城科工贸有限公司)；循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型(郑州长城科工贸有限公司)；超净工作台：SW-OJ-2F型(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；立式蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。柱层析硅胶(100-200目、200-300目及300-400目)及薄层层析硅胶(硅胶H)均为青岛海洋化工厂生产；液相色谱柱：HypersilBDS5μmC18(250×4.6and250×10；Thermo)；羟丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20和RP-C18反向硅胶均为Merck公司生产。1.1合成路线：将2,4-二羟基苯乙酮(A)(1.52g，10mmol)溶解于20mL的80％(体积比)乙酸中[8,9]，随后向该溶液中滴加10mL溴的乙酸溶液(2.0M，含3.2g溴)，室温下保持搅拌15min。TLC检测反应完毕后得到浅红色固体，用苯进行重结晶得到的白色晶体即为产物B，产率67％(按质量计)。取0.2mmol产物B置于25mL的干燥的圆底烧瓶中[10,11]，加入5mL的无水二氯甲烷溶解，再依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCl，1.2equiv.按质量计)和DMAP(5％，按质量计)，搅拌至溶解后加入3-苯基丙酰氯(1.1equiv.按质量计)，保持室温搅拌。经TLC检测反应完毕后用20mL二氯甲烷萃取，分别使用饱和碳酸氢钠溶液(1×10mL)、水(2×10mL)和饱和氯化钠溶液(2×10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥15min。减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯)＝15:1～4:1(体积比)梯度洗脱，结合图1，梯度洗脱得到组分A-E,其中组分D鉴定为化合物BA36，产率87％(按质量计)。[8]DuanF,LiX,CaiS,XinG,WangY,DuD,HeS,HuangB,GuoX,ZhaoH,ZhangR,MaL,LiuY,DuQ,WeiZ,XingZ,LiangY,WuX,FanC,JiC,ZengD,ChenQ,HeY,LiuX,HuangW.2014.HaloemodinasnovelantibacterialagentinhibitingDNAgyraseandbacterialtopoisomeraseI.JournalofMedicinalChemistry,57(9):3707–3714.[9]WangY,DongH,ZhaoF,WangJ,YanF,JiangY,JinY.2016.ThesynthesisandsynergisticantifungaleffectsofchalconesagainstdrugresistantCandidaalbicans.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,26(13):3098-3102.[10]SchreinerEP,WolffB,WiniskiA,BillichA.2003.6-(2-Adamantan-2-ylidene-hydroxy-benzoxazole)-O-sulfamate:Apotentnon-steroidalirreversibleinhibitorofhumansteroidsulfatase.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,13(24):4313–4316.[11]JiH,ZhangW,ZhangM,KudoM,AoyamY,YoshidaY,ShengC,SongY,YangS,ZhouY,LüJ,ZhuJ.2003.Structure-baseddenovodesign,synthesis,andbiologicalevaluationofnon-azoleinhibitorsspecificforlanosterol14α-demethylaseoffungi.JournalofMedicinalChemistry,46(4):474–485.1.2苯乙酮类化合物BA36的理化性质分别为：本发明的苯乙酮类化合物的理化性质：白色固体，熔点126～128℃，收率87％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(s,1H),7.46(d,J＝7.5Hz,2H),7.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.25(t,J＝7.0Hz,1H),2.92(m,2H),2.80(m,2H),2.64(s,3H)(图2).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ202.8,168.5,159.9,152.2,139.7,133.0,128.8,128.4,126.6,119.1,108.7,106.2,35.5,30.6,26.8.(图3)。1.3细胞毒活性测定选取人抗肝癌细胞HepG2与人恶性神经胶质瘤癌细胞U87对化合物的抗肿瘤活性进行初步评价。细胞由本实验室保存。采用CCK-8法测定细胞毒活性[12]。具体操作如下：取处于对数生长期细胞接种于96孔板里(细胞浓度为20000个/mL，150μL/孔)，培养24h使细胞贴壁，去除上清，加200μL加有化合物的新鲜培养基(化合物事先溶解在DMSO中，测试时用细胞培养基稀释成所需浓度，注意DMSO的终浓度不能超过0.1％)。每个浓度设3个复筛孔，并设空白对照孔(只加培养基)和阴性对照，设置6个复筛空。继续培养至48h，终止培养，避光状态下，每孔中加入10μLCCK-8试剂，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养4h。取出后用酶标仪在450nm处测定吸光度，并计算抑制率。表1为测定结果。参考文献：[12]邵军丽,李林秋,戴娟秀,陈婷婷,翟璐.CCK-8试剂用于测定活细胞数量的细节研究[J].生物技术世界,2016(05):31-32.表1苯乙酮类化合物对肝癌细胞HepG2与人恶性神经胶质瘤瘤癌细胞U8748h的IC50(μM)化合物U87HepG2BA-36(μM)166该苯乙酮类化合物对人恶性神经胶质瘤癌U87和肝癌细胞HepG2的IC50值均小于20μM，其对人恶性神经胶质瘤癌U87和肝癌细胞HepG2的IC50值分别为16μM和6μM。1.4对肝癌细胞HepG2周期的影响取处于对数生长期细胞接种于培养瓶中(细胞浓度为100000个/mL，5mL/瓶)，37℃，5％CO2培养24h使细胞贴壁，去除上清，加5mL加有化合物的新鲜培养基(化合物事先溶解在DMSO中，测试时用细胞培养基稀释成所需浓度，注意DMSO的终浓度不能超过0.1％)。化合物浓度分别为10μM、5μM和2.5μM，0μM(对照)，处理24h。胰酶消化后，分别收集不同浓度的所有细胞，1000rpm离心5min，收集沉淀，加入1mL冰浴PBS重悬细胞。向每管细胞中加入10μL提前配制好并用0.25pm滤膜过滤的20mg/mL的Hoechst染液，37℃染色20min。用1mLPBS洗涤细胞，再用1mLPBS重悬细胞，低速涡旋振荡的同时缓慢将细胞悬液加入4mL冰浴预冷的95％乙醇固定。弃去上清液，加1mLPBS洗涤，再加1mLPBS重悬，上流式细胞仪检测结果。参考文献：[11]陈东英.淫羊藿苷对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响[硕士学位论文].兰州：兰州大学,2018.结果如(图4)所示：结果表明随着细胞被该苯乙酮化合物BA36的处理浓度的增加，肝癌细胞HepG2停留在细胞周期的G2/M期的细胞数量比例明显增加。表明该苯乙酮化合物BA36能促进细胞停留在细胞分裂周期的G2/M。表明该化合物在开发抗肝癌的药物发面有很大的潜力和应用前景。1.5对肝癌细胞HepG2凋亡的影响取处于对数生长期细胞接种于6孔板中(细胞浓度为100000个/mL，2mL/孔)，37℃，5％CO2培养24h使细胞贴壁，去除上清，加2mL加有化合物的新鲜培养基(化合物事先溶解在DMSO中，测试时用细胞培养基稀释成所需浓度，注意DMSO的终浓度不能超过0.1％)。化合物浓度分别为5μM、2.5μM，1.25μM，处理48h。胰酶消化后，分别收集不同浓度的所有细胞，1000rpm离心5min，收集沉淀，加入1mL冰浴PBS重悬细胞。向每管细胞中加入200μL提前配制好的缓冲液(0.5mL缓冲液(4X)+1.5mL去离子水)，转移到1.5mL离心管中，加入10μLAnnexinV-FITC染液混匀，室温育孵10min后4℃保存1h，每管样品加入PI染料染色，上流式细胞仪分析结果。结果如(图5)所示；结果表明随着浓度的增加该苯乙酮类化合物BA36使肝癌细胞HepG2早期凋亡与晚期凋亡的细胞数量明显增加，结合细胞周期检测结果，预测该化合物作用与CDK1/CyclinA/p53酶有关。表明该化合物在开发抗肝癌的药物发面有很大的潜力和应用前景。当前第1页1 2 3